载CXCL12抗体靶向超声微泡制备及其体外卵巢癌细胞粘附性实验①

2021-11-10 10:21付丽君曾倩倩
新疆医科大学学报 2021年8期
关键词:造影剂卵巢癌靶向

付丽君,向 红,曾倩倩,胡 蓉

(新疆医科大学第一附属医院妇产超声科,乌鲁木齐830054)

通常患者被诊断为卵巢癌时,肿瘤已经发展到中晚期,且肿瘤病灶已经发生转移,从而导致患者失去早期治疗时机,预后差[1-2]。卵巢癌的早期诊断能够提高患者的生存率[3-4]。在临床上,超声造影技术应用较为广泛,近年来,该技术有了飞速的发展[5],而靶向超声微泡可在微泡表面上携带靶分子抗体,借助抗原抗体的特异性结合,在靶器官或靶组织区停留,实现特异性增强显影[6-7]。研究表明,基质细胞延伸因子1(CXCL12)能够与其趋化因子受体CXCR4组合,从而形成信号轴CXCL12/CXCR4,该信号轴可以对卵巢癌细胞进行调控[8-9]。本研究以CXCL12作为研究靶点,通过采用生物素-亲和素连接法将CXCL12抗体与普通微泡结合制备携CXCL12抗体的靶向超声微泡,通过一般物理特性检测和细胞爬片实验,评价靶向微泡与靶组织的体外结合能力,旨在为肿瘤的早期诊疗研究提供实验数据。

1 材料和方法

1.1 主要材料人卵巢癌细胞株SKOV3(购自武汉普诺赛生命科技有限公司),高糖培养基(Hyclone公司);磷酸盐缓冲液;胎牛血清(Hyclone,USA);Anti-CXCL12(博奥森生物科技有限公司);链酶亲和素(Streptavidin,SA,Sigma,USA);罗丹明标记山羊抗兔IgG(北京中衫金桥);凝胶制备试剂盒(Solarbio公司)。

1.2 培养人卵巢癌细胞株SKOV3细胞

1.2.1 细胞复苏 将SKOV3细胞放到提前加热好的水浴锅中,使得冻存的细胞快速溶解开。待冻存管中的细胞基本上融化后,于离心机中离心5 min。弃去离心过的细胞上清液,剩下冻存管中的下层细胞小心放到超净台上,防止细胞污染,最后加入培养基,用取样枪进行吹打混匀后,培养并观察。细胞悬液分装至培养瓶中,在37℃、5%CO2条件下进行培养。

1.2.2 细胞传代 细胞生长状态良好,密度为90%左右时,进行传代培养。弃去旧的培养基,PBS清洗2遍,根据细胞密度加入适当量的0.25%胰蛋白酶消化液,显微镜下观察细胞形态,待细胞变圆变亮时加入2~3 mL完全培养基终止反应,使用培养液将细胞从培养瓶壁吹打脱落,转移至新的15 mL管。室温离心弃上清(1 000 r/min,5 min),加入适量完全培养基重悬细胞,按实验所需调整细胞密度,按1:2进行传代,将细胞转移至新培养瓶中继续置入培养箱中培养。

1.3 制备普通超声造影剂及携CXCL12抗体靶向超声造影剂

1.3.1 实验分组 携带CXCL12抗体靶向超声造影剂为实验组,以未连接CXCL12抗体的声诺维微泡作为对照组。

1.3.2 配制普通超声造影剂 准备好声诺维冻干粉,用生理盐水溶解,体积为5 mL,充分混匀之后,把造影剂放置在冰箱冷藏室中待用,后续实验在24 h内完成。

1.3.3 配制靶向超声造影剂 本实验要制备携带CXCL12抗体靶向超声造影剂,使用的方法是生物素-亲和素桥接法,该方法的过程为:(1)准备好声诺维冻干粉,用磷酸盐缓冲液溶解,体积为3 mL,加入物素化脂质,重量为450 μg,在0℃条件下,用恒温水平摇床摇晃,时间为45 min,然后静置0.5 h,使其可以分层,分层之后去掉下层溶液,洗涤2次,收集上层乳白色微泡。(2)按10 μL/mL的比例在乳白色微泡中滴加链霉亲和素,放置在0℃避光环境中,时间为0.5 h,使其可以分层,分层之后去掉下层溶液,收集上层乳白色微泡,按10 μL/mL的量加入抗CXCL12抗体,放置在0℃环境中,时间为0.5 h,使其可以分层,分层之后去掉下层溶液,收集上层乳白色微泡,放入4℃条件中保存待用,后续实验在24 h内完成。

1.3.4 间接免疫荧光观察靶向微泡 分别在配制好的普通超声造影剂和靶向超声造影剂中加入罗丹明标记山羊抗大鼠IgG,混合均匀后,放置在0℃避光环境中,时间为0.5 h,使其可以分层,分层之后去掉下层溶液,收集上层,于荧光显微镜下检测。

1.3.5 靶向造影剂的粒径检测和流式细胞仪检测取制备好的CXCL12靶向超声造影剂混悬液,测定微泡的粒径大小。应用流式细胞仪测定结合率,并于手摇震荡后再次测定结合率。每组各检测10个样本,并以非靶向造影剂对照。

1.4 体外寻靶当细胞贴壁之后,继续在CO2培养箱中培养1 d,取出做细胞爬片。制作空白对照组细胞爬片和实验组细胞爬片,每组各准备3张细胞爬片。去掉培养液,冲洗细胞,使死亡细胞被去除,使用的清洗液是PBS。操作方式:(1)在实验组载玻片中加入靶向脂质微泡超声造影剂,体积为200 μL;(2)在空白对照组的载玻片内加入非靶向脂质微泡超声造影剂,体积为200 μL。轻轻摇晃,使其加入的微泡可以在载玻片内分散均匀,把爬片放入CO2培养箱内,让造影剂和卵巢癌SKOV3反应,时间为60 min。随后取出爬片,用缓冲液冲洗干净之后,置于光镜下观察结合情况。

1.5 统计学分析使用SPSS23.0软件对数据进行统计学分析,计量资料用均数±标准差(±s)表示,用单因素ANOVA检验和配对t检验分析组间差异,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 靶向超声微泡的一般物理特性普通声诺维微泡外观呈乳白色,光镜下呈圆形,分布均匀(图1A);加罗丹明标记的IgG荧光显微镜下观察,未见荧光(图1B)。携CXCL12抗体的靶向微泡肉眼观亦呈乳白色,大小均一、分布均匀(图1C);将罗丹明标记的IgG加入靶向微泡,荧光显微镜下观察,可以看见环状红色荧光(图1D)。表明IgG可以特异性地与CXCL12抗体的靶向微泡结合。对图2进行分析可以明确,(2.45±0.26)μm为微泡的平均直径。流式细胞仪检测发现,(1.67±0.04)%为对照组靶向微泡结合率,(87.77±2.83)%为实验组靶向微泡结合率,差异有统计学意义(P<0.05)(见图3);且手摇震荡靶向造影剂悬浊液有较好稳定性,流式细胞仪检测震荡后靶向造影剂携带率为(86.55±1.12)% ,与震荡前(87.77±2.83)%相比略降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 超声微泡镜光镜及荧光显微镜下观(×200)

图2 携CXCL12抗体靶向超声微泡粒径分布

图3 携CXCL12靶向超声微泡结合率与非靶向超声微泡比较

2.2 光镜下观察实验组与对照组微泡对卵巢癌SKOV3细胞的结合情况实验组微泡与人卵巢癌SKOV3细胞充分孵育后,通过400倍光镜观察,镜下可见微泡分布不均匀,向细胞区域聚集。用PBS冲洗,次数为3次,置于镜下观察,可见细胞膜周围粘附有大量微泡,平均值为(7.5±0.5)个;而对照组微泡仅可见数个游离的微泡,与细胞无粘附关系,平均值为(1.5±0.3)个,差异有统计学意义(P<0.05);用 PBS 冲洗,次数为3次,置于镜下观察,试验组可见细胞间隙无微泡存在,细胞膜周围粘附有花环状的微泡(见图4A),对照组微泡镜下未见微泡粘附细胞(见图4B)。可见携带CXCL12抗体的靶向超声微泡在体外可与人卵巢癌SKVO3细胞实现特异性粘附。

图4 实验组微泡(A)对照组微泡(B)卵巢癌细胞爬片镜下观(×400)

3 讨论

与传统的诊疗技术相比,分子影像技术可通过影像手段在体显示基因表达、生物信号轴等复杂机制,为疾病的早期发现和靶向性治疗提供了新依据。生物素-亲和素桥接法因其特殊优势是应用最广泛的制作靶向微泡造影剂的方法[10-11],生物素-亲和素桥接法具有高度专一性,不影响抗体分子活性,也不会在孵育和各种洗涤过程中脱落,可以稳定存在于液相中。本研究采用这一方法,将商品化的声诺维超声微泡与CXCL12单抗结合,成功制备了携带CXCL12抗体的靶向超声微泡,微泡大小分布均匀,和对照组相比,结合率较高,稳定性较好;在施加一定外力对其进行震荡之后再次对结合率进行检测,前后差异无统计学意义,结果说明所制备的靶向微泡结合牢固、稳定性好。将载CXCL12抗体靶向微泡与人卵巢癌SKVO3细胞孵育后镜检显示,靶向微泡呈现出不均匀分布,说明存在聚集现象。观察对照组,微泡呈现出均匀分布,说明不存在聚集现象。用冲洗液冲洗,可以观察到对照组几乎无微泡粘附癌细胞。观察实验组,依然发现癌细胞表面有较多微泡环绕,其余部分无微泡存在,靶向微泡粘附率明显高于非靶向微泡。无论是流式细胞仪还是荧光显微镜,均表明CXCL12抗体与靶向微泡成功连接,并且可以与卵巢癌SKVO3细胞特异性结合。细胞分子水平的体外寻靶实验是进一步应用于在体及将来开展临床应用的前期实验研究,该实验为制备的CXCL12靶向超声微泡能否进一步开展体内实验提供了一系列的实验数据。体外实验和小动物实验的成功,也是为大动物模型及向临床应用提供了方法学参考。靶向超声造影剂应用于在体评估时,环境复杂,对靶向微泡的稳定性及对组织靶点的特异粘附性提出了挑战,因此对靶向微泡进行物理特性的检测,以及体外寻靶实验是否成功是十分关键的。

卵巢癌微环境中CXCL12表达量从无到有,标志着卵巢癌获得了具有恶性生物学行为的新表型,而且随着CXCL12在卵巢癌微环境中表达量的增加,卵巢癌细胞也更加具有了恶性行为。趋化因子CXCL12与其受体CXCL4结合所形成的CXCL12/CXCR4生物学信号轴广泛参与机体的生理病理过程,在促卵巢癌生长中发挥多重关键作用:(1)促进癌细胞增殖、迁移和分化;(2)招募肿瘤干细胞,促进肿瘤复发和转移;(3)通过多种途径促进肿瘤血管生成;(4)介导免疫功能障碍;(5)形成耐药性。因此在卵巢癌早期诊断、临床治疗、评价预后、预测抗药性方面的研究中,CXCL12已成为卵巢癌微环境的重要研究靶点[12]。

综上所述,本研究利用生物素-链霉亲和素法所制备的携带CXCL12抗体的靶向超声微泡粒径分布均匀并且具有较好的稳定性和较高的浓度。在与人卵巢癌SKVO3细胞株共孵育的体外寻靶实验中,表现出特异性的粘附能力,为后期动物模型的在体实验提供了一定的理论依据。

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