油松叶低极性成分的GC-MS法分析及其抗真菌活性研究

郑 巍，郭良君*，金永生

(1.陆军第七十二集团军医院药剂科，浙江湖州 313000；2.海军军医大学药学院有机化学教研室，上海 200433)

近年来，随着深部真菌感染的逐年增多，抗真菌药物的频繁应用，真菌耐药问题日益凸显。白念珠菌(Candidaalbicans)是最常见的致病菌，氟康唑(fluconazole)是临床上首选的抗白念珠菌感染药物，但是长期和重复给药导致白念珠菌对氟康唑耐药越来越严重[1-2]。为应对日益加剧的真菌耐药，从植物源性药物中发掘与抗真菌药物具有协同增效作用的小分子化合物是近年来的研究方向之一[3]。油松叶为松科植物油松PinustabulaeformisCarr.的针状叶，主产于吉林南部、辽宁、河北、河南、山东、山西、内蒙古等地[4]。《中药大辞典》中记载：“松叶味苦，温。有祛风燥湿，杀虫，止痒之功用。民间用松毛煎汤治疗湿痒、顽癣”[5]。现代药理学研究也表明，油松叶提取物具有抗炎、镇痛、改善心肌缺血及抑菌等多种活性。油松叶的抗真菌作用研究显示，其挥发油、乙醇提取物具有较强的真菌抑制作用[6-9]。但对油松叶的协同抗真菌作用未见报道。因此，本文以油松叶为研究对象，采用醇提后再用石油醚萃取的方法得到低极性部位，通过测定油松叶低极性部位联合氟康唑对耐药白念珠菌的最小抑菌浓度(MIC80)值，探究其对氟康唑的增效活性，同时采用气相色谱-质谱(GC-MS)法对低极性部位的化学成分进行分析鉴定，深入探讨油松叶的协同抗真菌成分。

1 材 料

1.1 仪器和菌株 Thermo Trace GC Ultra气相色谱及Thermo DSQ Ⅱ质谱(美国赛默飞世尔公司)。氟康唑耐药的白念珠菌103(MIC80>128.0 μg/ml)由海军军医大学长海医院真菌室赠送。

1.2 药品和试剂 油松叶于2018年采集自浙江省东阳市，经海军军医大学药学院生药学教研室黄宝康教授鉴定为油松PinustabulaeformisCarr.的新鲜枝叶。氟康唑注射液(批号B348806，辉瑞制药公司)；黄芩素(纯度≥98%，批号2022563，上海历鼎生物技术有限公司)；二甲亚砜(DMSO，中国医药集团上海化学试剂公司)； 所有试剂均为市售分析纯，水为重蒸水，载气为高纯氦气。

2 方 法

2.1 油松叶低极性部位的制备 取干燥油松叶，粉碎，称取2份，每份10.0 g，分别用50 ml石油醚和80%乙醇加热回流提取1 h，过滤；滤渣再分别用50 ml石油醚和80%乙醇加热回流提取1 h，过滤。合并两次滤液，旋转蒸发仪减压浓缩，回收溶剂，得石油醚提取物(PE)0.57 g和80%乙醇提取物(ET)2.18 g。取干燥后的ET 1.0 g，加入水50 ml混溶，将所得混悬液用20 ml石油醚萃取3次，合并浓缩石油醚萃取液，得石油醚浸膏即油松叶低极性部位(ET-PE)0.28 g。取125 mg ET-PE浸膏，置于100 ml量瓶中，加入80%甲醇，超声、加热使其几近完全溶解，放置，冷却；再加入80%甲醇定容，摇匀，放置；吸取1 ml定容后的浸膏液，微孔滤膜(孔径 0.45 μm)过滤后待测。

2.2 药敏试验 采用美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standard Institute,CLSI)提出的RPMI 1640 培养基微量稀释法，取无菌96孔板，于每排1号孔加RPMI 1640液体培养基100 μl作为空白对照；3～12号孔各加新鲜配制的白念珠菌103菌液100 μl，菌液浓度范围为(1～5)×103cfu/ml；2号孔分别加菌液160 μl和受试药物溶液40 μl，使药物终浓度为250.0 μg/ml；2～11号孔分别加入倍比稀释后的药物，使各孔的最终药物浓度分别为125.0、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49和0.245 μg/ml；12号孔不含药物，只加菌液100 μl作阳性生长对照。各孔中DMSO含量均<1%，氟康唑溶液的终浓度为8.0 μg/ml。96孔板于37 ℃恒温培养箱培养24 h后取出，读取受试药物与氟康唑(8.0 μg/ml)联用时的MIC80值。协同药效的判定采用联合抑菌浓度分数指数(FICI)，即联用抑菌时每种药物所需MIC80与单用这种药物抑菌时所需MIC80的比值的和。当FICI≤0.5时，两种药物的相互作用效果被定义为具有协同作用；当FICI>0.5时，认为两种药物无相互作用。

2.3 色谱和质谱条件 色谱柱为TR-35MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，程序升温，起始温度40 ℃，保持 2 min后以10 ℃/min的速度升至300 ℃并保持5 min；汽化温度250 ℃，进样量1 μl；分流比10∶1。载气是高纯氦气，流速1.0 ml/min。离子源：EI源；离子源温度为250 ℃；电子能量：70 eV；m/z扫描范围：50～650。

3 结 果

3.1 油松叶提取物联合氟康唑的药敏试验结果 如表1所示，各受试药物单用时，对照品黄芩素(BE)的 MIC80为 15.63 μg/ml，提示其具有一定的抗菌活性，其他化合物的MIC80均>250 μg/ml。各受试药物与氟康唑(8.0 μg/ml)联用后，对照品BE、油松叶80%乙醇提取物(ET)及油松叶低极性部位(ET-PE)的MIC80降至1.95 ～ 3.91 μg/ml，其FICI均<0.5，显示BE、ET、ET-PE与氟康唑联用对耐药白念珠菌具有协同抗菌作用。PE单用及与氟康唑联用的MIC80均>250 μg/ml，FICI>0.5，显示其没有协同氟康唑抗耐药白念珠菌的作用。

表1 油松叶3种提取物与氟康唑联用体外抗白念珠菌103活性的80%最小抑菌浓度(MIC80)Table 1 The 80% minimal inhibitory cencontrations(MIC80) of three extracts from Pinus tabulaeformis Carr.leaves combined with fluconazole against Candida albicans 103 in vitro

3.2 油松叶低极性部位的化学成分 按照2.3项下色谱条件进样后5 min，得到油松叶低极性化学成分的总离子流图(见图1)。共检测出30个峰，通过检索NIST08光谱数据库，按60%以上匹配率(SI和RSI均>600，最大值1000)，并结合质谱裂解规律确定其化学成分。采用峰面积归一法通过Xcalibur化学工作站数据处理系统，测得各个化学成分在油松叶低极性部位中的质量百分数。

本研究共检测并鉴定出 30个化合物， 见表2。

图1 油松叶低极性化学成分的总离子流谱图Figure 1 Total ion chromatogram of low polarity components from Pinus tabulaeformis Carr.leaves

表2 油松叶低极性化学成分的GC-MS法分析结果Table 2 Analysis results of low polarity components of Pinus tabulaeformis Carr.leaves by GC-MS method

(续表2)

本次所测油松叶的低极性化学成分中含有脂肪酸(酯、醇)5个(11.16%)，甾烷类6个(18.69%)，倍半萜9个(30.62%)，二萜8个(35.17%)，其中含量较高的两个主要化学成分是15-羟基脱氢枞酸甲酯(含量11.73%，见图2)和脱氢枞酸甲酯(含量7.67%，见图3)。

图2 15-羟基脱氢枞酸甲酯和化合物29的质谱比较Figure 2 Comparison of the mass spectra of 15-hydroxydehydroabietic acid,methyl ester and compound 29A：15-羟基脱氢枞酸甲酯；B：化合物29

图3 脱氢枞酸甲酯和化合物22的质谱比较Figure 3 Comparison of the mass spectra of methyl dehydroabietate and compound 22A:脱氢枞酸甲酯;B:化合物22

4 讨 论

白念珠菌是引起皮肤黏膜和系统性真菌感染的常见病原菌。临床可用的抗真菌药物种类有限，主要包括唑类、棘白菌素类和多烯类抗菌药物。氟康唑是临床使用最广泛的抗生素之一，但由于滥用和长期治疗等原因导致耐药问题日益严重[10]。目前，从植物中筛选出一些自身抗真菌活性较弱或无抗真菌活性，但能对抗真菌药物有协同作用的化学成分并与之联合使用是一个重要的研究方向。油松叶提取物作为一种天然的植物成分，资源丰富，有抗氧化、抗炎、镇痛等多种药理活性，但有关其抗真菌作用的报道很少，未见抗耐药白念珠菌作用的报道。

本研究发现油松叶的PE和ET单用时均无抗耐药白念珠菌活性，但与氟康唑(8 μg/ml)联用后，ET表现出抗耐药白念珠菌活性，而PE依然没有活性。继续对ET进行分段萃取，获得油松叶低极性部位(ET-PE)，协同实验显示其单用时也没有抗耐药白念珠菌活性，但联用氟康唑(8 μg/ml)后，表现出协同作用。这表明ET和ET-PE是有效的氟康唑抗真菌增效剂。乙醇属于亲水性有机溶剂，对各类化学成分的溶解度都较好，提取成分较石油醚提取更全面，因此ET的氟康唑增效作用可能源于其比PE具有更丰富、含量更高的化学成分。ET-PE进一步富集了ET的低极性化学物质，依然具有氟康唑增效作用，这些低极性化学物质可能包含了一些重要的活性抗真菌成分。进一步对活性部位ET-PE进行GC-MS化学成分分析，结果显示其化学成分主要为以石竹烯、枞酸甲酯为代表的倍半萜及二萜类物质。而文献报道油松叶挥发油的主要化合物是以蒎烯、茨烯和石竹烯为主的单萜、倍半萜及其含氧化合物。药理研究结果显示，蒎烯具有抗真菌作用，对白念珠菌有明显的抑菌和杀菌作用[11]。与文献比较，本研究所获得的低极性成分缺少了油松叶挥发油中以蒎烯为主的单萜类成分，但分子量更大的倍半萜(30.62%)、二萜(35.17%)类化学成分含量升高。蒎烯等单萜类成分的缺失可能是ET-PE单用对耐药白念株菌无抗菌作用的原因之一。ET-PE中的倍半萜类成分含量最高的是石竹烯及其氧化物(6.36%)。文献报道石竹烯及其氧化物对红色毛癣菌、须毛癣菌等具有显著的抗真菌活性[12]。ET-PE中含量最高的二萜类成分是脱氢枞酸甲酯(19.4%)，这也是松香酸的主要成分[13]。文献报道松香酸对赤霉菌、灰霉菌等具有抗真菌活性[14-15]。因此，ET-PE中的倍半萜和二萜类化合物可能是其协同氟康唑抗耐药白念珠菌作用的重要活性成分，值得进一步研究。

综上所述，本研究首次报道了油松叶ET以及ET-PE具有协同氟康唑抗耐药白念珠菌作用，可以作为联合用药的候选药物来解决氟康唑的耐药问题，且来源丰富，具有较好的开发前景，但其协同氟康唑抗耐药白念株菌的作用机制有待进一步的研究。另外，本研究首次对油松叶ET-PE进行了GC-MS分析，鉴别的化合物中β-石竹烯、ç-木罗烯、(-)-桉油烯醇、氧化石竹素、τ-木罗醇、α-毕橙茄醇、α-愈创木烯、西松烯、浙麦角醇等倍半萜类成分与油松叶挥发油成分有重合，而环氧异香树烯、1,5,5,8-四甲基双环[4.2.1]壬)-乙酸、植物醇、脱氢枞酸甲酯与油松幼枝、松果挥发油的GC-MS分析结果有重合，其他化合物均为首次从该植物中发现，丰富了油松叶的化学成分[16-20]。