基于网络药理学与分子对接技术的平消胶囊干预结肠癌的作用机制研究

蔡孟成,张慧卿,谢 玮,金永生

(1.海军军医大学基础医学院,上海 200433;2.海军军医大学中医系,上海 200433;3.海军军医大学药学院有机化学教研室,上海 200433)

平消胶囊是临床常用的抗肿瘤中成药，广泛用于包括结直肠癌在内的各类常见恶性肿瘤的治疗，其由《金匮要略》硝石矾石散增补而来，由硝石、矾石、马钱子、郁金、枳壳、五灵脂、干漆、仙鹤草八味中药构成，具有活血散结、扶正解毒的功效，可缓解癌痛症状、缩小瘤体。近年来研究表明，我国结肠癌的发病率呈逐年上升趋势，其发病率高居整体肿瘤的第三位，而平消胶囊对于提高患者生存质量和延长生存期起到了积极作用，且其毒副作用轻微，可长期服用[1]，但具体作用机制尚不明确。本文旨在运用网络药理学与分子对接技术探讨平消胶囊治疗结肠癌的物质基础与作用机制，为肿瘤精准治疗提供新的治疗选择，并为抗肿瘤药物的研发提供新思路。

1 材料和方法

1.1 药物与疾病靶点的筛选 本研究采用中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP，网址http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)检索中药郁金、仙鹤草、枳壳、马钱子的活性成分；TCMSP数据库中未收录五灵脂、矾石、硝石、干漆四味中药，故通过中医药综合数据库(Traditional Chinese Medicine Integrated Database,TCMID)检索获取收录的四味中药的活性成分，再利用TCMSP数据库得到对应化合物的靶点。根据化合物口服生物利用度(oral bioavailability,OB)与类药性(drug-likeness,DL)进行筛选，OB阈值设为OB≥30%，DL阈值设为DL≥0.18，并采用TCMSP数据库获得活性成分对应的靶点[2]。利用美国国家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的医学主题词表(Medical Subject Headings,MeSH)检索结肠癌(colon cancer)的主题词，得到colonic neoplasm；再从Entry Terms选择“colon cancer”、“cancer of colon”等疾病相关词汇，再利用GeneCard数据库获取与结肠癌直接相关的靶点。检索日期均为2020-10-22。

1.2 构建化合物-靶点网络 为明确疾病相关靶点与平消胶囊相关靶点之间的关系，将上述两部分靶点进行交集，输入Cytoscape 3.6.1软件构建化合物-靶点网络。Cytoscape软件的核心架构是网络，每个节点是基因、蛋白质或分子，节点与节点之间的连接代表这些生物分子之间的相互作用，节点的度值代表网络中节点与节点相连的数目。

1.3 构建蛋白质-蛋白质相互作用网络 为更深层次探究靶点蛋白质之间的相互作用，将统计所得的疾病-药物靶点基因上传至在线STRING10.5软件(http://string db.org)，上传时间为2020-10-24，构建蛋白质-蛋白质相互作用网络(protein-protein interaction network,PPI)模型。物种选择为人(homosapiens)，参数保持默认设置，获取PPI。

1.4 生物过程与通路分析 利用Cytoscape软件中的ClueGo功能对药物和疾病的公共靶点进行基因本体(gene ontology,GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析，其中GO富集分析包括细胞组成(cellular component, CC)、生物过程(biological process, BP)以及分子功能(molecular function, MF)三个部分，保存结果。设定阈值P<0.05，将结果可视化。

1.5 分子对接 从蛋白质结构数据库(Protein Data Bank, PDB，网址https://www.rcsb.org/)下载淀粉样前体蛋白(APP)与雌激素受体1(ESR1)两个蛋白的三维晶体结构(PDB ID为4LXM和4XI3，PDB格式)，从Pubchem数据库(https://pub chem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载槲皮素、木犀草素和山奈酚的三维结构(CAS号为117-39-5、491-70-3和520-18-3，PDB格式)，下载时间均为2020-10-29，采用Pymol-2.4.1删除靶蛋白的配体，然后利用AutoDock Tools 1.5.6软件删除靶蛋白的水分子，添加非极性氢，计算Gasteiger电荷，保存为PDBQT格式的文件。将已经保存为PDB格式的化合物导入AutoDock Tools 1.5.6，添加原子电荷，分配原子类型，所有柔性键均默认可旋转，保存为PDBQT格式，作为对接配体。运行AutoGrid与AutoDock 进行对接，并利用Pymol软件将结果可视化。

2 结 果

2.1 筛选药物活性成分 通过TCMSP检索到郁金、仙鹤草、枳壳、马钱子中化合物共342个活性成分，其中222个来自郁金、17个来自枳壳、62个来自马钱子、41个来自仙鹤草。以OB≥30%且DL≥0.18筛选出化合物38种，其中15个来自郁金、5个来自枳壳、13个来自马钱子、5个来自仙鹤草。通过查阅TCMID数据库获取五灵脂中化合物共39个，干漆中化合物1个，矾石的主要成分为KAl(SO4)2·12H2O，硝石的主要成分为KNO3。将其逐个输入TCMSP，按照上述标准进行筛选，共获取3个化合物。去除重复化合物后共发现平消胶囊中活性物质37个，可入血的活性成分20个，并获取对应的药物成分靶点共113个，化合物见表1。从GeneCards数据库中获得21 151个与结肠癌直接相关的靶点。

2.2 化合物-靶点相互作用网络构建 采用Cytoscape 3.6.1软件构建的化合物-靶点相互作用网络包含20个化合物节点、113个靶点节点和274条边，用红色菱形表示化合物，绿色圆形表示靶点，连接化合物与靶点的边表示两者之间有作用关系(见图1)。

图1 平消胶囊主要成分-靶点网络图Figure 1 Network diagram of main component-target of Pingxiao capsules

依据网络拓扑学性质可知， 有较多节点的化合物或药物靶点在整个网络中可能起到关键的作用，因此本研究筛选节点度较大的节点进行分析。排名前5位的化合物分别为槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、川陈皮素(nobiletin)、β-谷甾醇(β-sitosterol)，分别能与76、33、28、18、16和15个靶点蛋白质发生作用。从靶点的角度看，degree排名前5位的是前列腺素过氧化物合酶1(PTGS1)、核受体共活化剂2(NCOA2)、过氧化物酶体增生激活受体γ(PPARG)、毒蕈碱型胆碱受体 M1(CHRM1)、孕激素受体(PGR)，分别能与11、11、8、8和7个化合物发生相互作用，体现了中药多靶点的特性。

2.3 平消胶囊靶点PPI的构建与分析 应用STRING软件构建PPI (见图2)，在此网络图中包含95个节点，948条边，同时得到网络中关键靶点的频次。根据“度值>均值”筛选出关键节点40个，前20个包括APP、ESR1、EGFR、RELA、FOS、CCND1、NCOA1、MAPK8、NR3C1、IL6、AR、APOB、CASP3、CASP8、CYP1A1、NCOA2、GSK3B、PRKCA、RB1、VEGFA。度值最高的是APP和ESR1(度值为32)，其次为EGFR和RELA(度值为30)。度值大的靶点提示在网络中起着关键作用，可能是平消胶囊治疗结肠癌的关键靶点。

2.4 GO富集与通路富集分析 GO生物过程条目主要包括：核受体活性、胞内应激反应的调节、对血管内皮细胞移动的调节、胞内有机氮化合物的反应以及在凋亡过程中半胱氨酸性肽链内切酶的活性等。分子功能包括：乙酰胆碱受体活性、调节凋亡过程中半胱氨酸性肽链内切酶的活性、RNA聚合酶Ⅱ-特定DNA转录因子结合、蛋白激酶催化剂活性以及跨膜受体蛋白酪氨酸酶活性；并且参与了细胞膜及细胞核结构的组成。KEGG富集分析(见图3)主要包括：肿瘤通路、糖尿病AGE-RAGE信号通路、乙型肝炎、子宫内膜癌、结直肠癌、ErbB信号通路、催乳素信号通路等通路。其中肿瘤通路占比最高(见图4)。

图3 平消胶囊干预结肠癌的KEGG富集分析图Figure 3 KEGG enrichment diagram of colon cancer regulated by Pingxiao capsules

图4 平消胶囊干预结肠癌的KEGG富集分析比例图Figure 4 KEGG enrichment ratio diagram of colon cancer regulated by Pingxiao capsules

2.5 分子对接 一般认为配体与受体结合的构象稳定时能量越低，发生作用的可能性越大。作者对平消胶囊中的槲皮素、木犀草素和山奈酚进行分子对接，对接模式见图5。槲皮素与 4LXM和4XI3分子对接的结合能分别为-5.10和-5.44 kJ/mol；木犀草素与4LXM和4XI3分子对接的结合能分别为-5.04和-5.58 kJ/mol；山奈酚与4LXM和4XI3分子对接的结合能分别为-5.02和-5.87 kJ/mol。结果表明，木犀草素、槲皮素和山奈酚通过与APP蛋白和ESR1蛋白结合而产生干预结肠癌的作用。

图5 平消胶囊主要活性成分与4LXM、4XI3分子对接模式Figure 5 Molecular docking model of 4LXM and 4XI3 with main components of Pingxiao capsulesA:槲皮素与4LXM分子对接；B：槲皮素与4XI3分子对接；C：木犀草素与4LXM分子对接；D：木犀草素与4XI3分子对接；E：山奈酚与4LXM分子对接；F：山奈酚与4XI3分子对接

3 讨 论

小分子靶向药物作为新型化疗药物可通过特异性阻断肿瘤增殖生长过程中所必需的信号转导通路，提高抗癌疗效。本研究通过网络药理学分析，发现槲皮素、木犀草素和山奈酚这些小分子化合物可能是平消胶囊抗结肠癌的主要化学成分。现代研究表明，槲皮素与靶向药物一起使用可以避免靶向药物产生耐药性[3]，且能够增强靶向药物的疗效，其机制可能是槲皮素通过抗氧化而抑制结肠癌细胞增殖[4]。木犀草素也具有促进结肠癌细胞凋亡的作用，其与ERK/FOXO3a依赖机制有关[5]。山奈酚则可能是通过抗氧化以及细胞毒发挥抗癌作用[6]。综上，三种活性成分都有促进癌细胞凋亡的作用，为今后平消胶囊联合靶向治疗增效减毒、改善耐药等方面提供新的思路。

PPI结果显示，APP与ESR1是平消胶囊治疗结肠癌的关键蛋白。陈霄等[7]研究表明，APP在结肠癌组织中高表达，并与结肠癌患者的预后呈负相关，提示APP可能是结肠癌患者预后的重要参考指标。GIROUX等[8]研究表明，对于自发性结肠腺瘤，清除ESR能够使腺瘤体积显著增加。在相同模型中，ESR再表达能显著下调有致瘤作用的miR-17-92及miR-200a/b的出现[9]，再次印证了蛋白质相互作用网络的结果。分子对接结果表明，平消胶囊的主要化学成分槲皮素、木犀草素、山奈酚对于两个关键蛋白质——APP和ESR1均有一定的结合能力，也为这三个活性成分能够治疗结肠癌提供了依据。GO和KEGG富集分析表明，平消胶囊抗结肠癌的机制主要与细胞凋亡有关。此外，其还能够调控乙酰胆碱活性，可以缓解癌痛症状；其涉及的信号通路以肿瘤信号通路为主，这也提示了平消胶囊不仅针对结肠癌，对于乳腺癌、甲状腺癌等也有一定作用。

由于硝石、矾石为矿物类药物，干漆为树脂类药物，均没有纳入网络药理学分析的范围。硝石中Cu、Ba、Na、Se、Ca是抗肿瘤作用的主要无机成分。Cr、Ca、Al、K是矾石能够抑制宫颈癌细胞生长的药效物质基础，作者推测这四种元素也是抑制结肠癌细胞生长的物质基础。KIM等[10]的研究表明，干漆中紫铆花素、非瑟酮以及硫磺菊素等6个活性成分具有抗增殖作用，这些可能是干漆抗结肠癌的活性成分。

综上所述，平消胶囊治疗结肠癌的有效成分可能是槲皮素、木犀草素、山奈酚等，这些成分可能是通过作用于APP以及ESR1蛋白调节肿瘤通路从而发挥促进细胞凋亡的作用。其中，槲皮素与靶向药物联合应用可避免靶向药物耐药性，今后可能针对具体的靶向药物深入开展机制研究，并有望成为中药有效成分单体用于结肠癌治疗的新研究方向。根据临床疗效并结合生物信息学技术阐明药物活性成分与疾病靶点的对应关系的方法，可以为中医药精准治疗结肠癌提供更好的理论依据和具体方向。