鸡肉中鲜味核苷酸测定方法研究

杨 露，谭会泽，温志芬，张祥斌，刘松柏，彭运智，邹 轶，陈 丹，韩敏义

(温氏食品集团股份有限公司农业部动物营养与饲料学重点实验室，广东 云浮 527400)

随着社会的进步和生活水平的提高，人们要求肉品质不仅有营养价值，而且要色香味俱全。肉中的风味主要包括鲜味、甜味、咸味、酸味和苦味五大类，而肉类及其制品的鲜味主要取决于氨基酸和核苷酸两大类物质。1985年在美国召开的第一次鲜味国际讨论会上，确定了鲜味的概念，将谷氨酸钠和5′-核糖核苷酸(5′-IMP、5′-GMP……)等化合物给予的独特滋味称为鲜味。研究证实，在畜禽肉中肌苷酸为鲜味最强的物质，鸟苷酸和腺苷酸也发挥了鲜味作用，它们通过一系列的降解过程产生多种具有鲜味的代谢产物[1]。

目前用于鸡肉中鲜味核苷酸的检测方法有化学滴定法、紫外分光光度法和高效液相色谱法。化学滴定法测定偏差较大，紫外分光光度法只能测定样品中总核苷酸的量，现在普遍利用高效液相色谱法测定禽肉中的单种鲜味核苷酸含量[2]。本研究通过分析鲜味核苷酸的化学特性，结合禽肉中鲜味核苷酸的提取方法，最终提炼出一套前处理简单方便快速且准确度高的可测定禽肉中三种鲜味核苷酸的高效液相色谱方法。

1 方法原理

样品中的鲜味核苷酸经5%高氯酸溶液提取，再与氢氧化钾溶液发生反应生成化学状态稳定的盐类物质，采用高效液相色谱(紫外检测器)测定，外标法定量。

2 材料与方法

2.1 材料

取一定量新鲜肉鸡胸肌样品于-20℃条件下保存待用。

2.2 试剂

色谱纯的甲醇，实验室一级水，磷酸盐缓冲溶液(pH 5.8)，无水磷酸二氢钾，无水磷酸氢二钾，高氯酸，5′-肌苷酸标准品(纯度≥99%)，5′-鸟苷酸标准品(纯度≥99%)，腺苷酸标准品(纯度≥98%)。

2.3 仪器及耗材

高效液相色谱(配有紫外检测器)，涡动仪，高速离心机，万分之一分析天平，十万分之一分析天平，超声波清洗器，0.22 μm有机滤膜，pH值计，高速组织匀浆机等。

2.4 高效液相色谱条件

(1)色谱柱：TC-C18柱(5 μm,φ4.6 mm×250 mm)；

(2)柱温：25℃；

(3)流动相：磷酸盐缓冲溶液+甲醇(95+5)；

(4)流速：0.60 ml/min；

(5)进样体积：20 μl；

(6)检测波长：254 nm；

(7)梯度洗脱设置：0～10 min，99%磷酸盐缓冲溶液和1%甲醇；12 min时，80%磷酸盐缓冲溶液和20%甲醇保持6 min；2 min内磷酸盐缓冲溶液升至99%，再保持8 min。

2.5 样品前处理

2.5.1试液制备

称取搅碎、均质的鸡肉样品2～3 g(精确到0.01 g)于50 ml离心管中，加20 ml在4℃冰箱中预冷1 h的5%高氯酸溶液，超声波提取5 min，在4℃下4 000 r/min离心10 min，取上清液。沉淀物再加20 ml预冷的5%高氯酸溶液。重复上述步骤，合并所有上清液于50 ml锥形瓶中，并用0.5 mol/L的氢氧化钾溶液调节pH值至5.8。从调好pH值的提取液中准确移取20 ml，定容到100 ml容量瓶中。取定容的试液适量经0.22 μm滤膜过滤至进样瓶中，待上机测定。

2.5.2回收率测定

将5′-IMP、5′-GMP、AMP三种物质的标准溶液加入试样后，按2.5.1节提供的方法处理制备样品溶液，以考察前处理对回收率的影响，结果见表1。

3 结果与分析

3.1 结果计算

样品中5′-IMP、5′-GMP、AMP三种鲜味核苷酸的含量Ci，按公式Ci=(CsAiV)/(Asm)计算。式中，Ci为样品中各种物质的含量，mg/g；Cs为标准工作液中各种物质的浓度，mg/ml；Ai为样品中各种物质所对应的峰面积响应值；As为标准工作液中各种物质所对应的峰面积响应值；V为样品提取液的总体积,ml；M为样品质量,g。

测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留4位有效数字。

3.2 标准曲线

将三种物质的标准混合溶液配制成含5′-IMP为12.5、25.0、50.0、62.5、125.0 μg/ml的标准工作液，含5′-GMP和AMP为2.5、5.0、10.0、12.5、25.0 μg/ml的标准工作液，按2.4节设定色谱条件进行色谱分析，以各个物质浓度为自变量(X)，相应的色谱峰面积响应值为依变量(Y)，建立标准曲线方程。结果表明,浓度为12.5～125 μg/ml，5′-IMP浓度与峰面积响应值之间具有良好的线性关系，回归方程计算为：Y=39.939 530 1X-308.903 46，相关系数R2=0.999 8。浓度为2.5～25.0 μg/ml，5′-GMP浓度与峰面积响应值之间具有良好的线性关系，回归方程计算为：Y=61.583 628 7X-96.722 597，相关系数R2=0.998 0。浓度为2.5～25.0 μg/ml，AMP浓度与峰面积响应值之间具有良好的线性关系，回归方程计算为：Y=76.170 150 8X-104.692 94，相关系数R2=0.997 0。

3.3 回收率测定

将5′-IMP、5′-GMP、AMP三种物质的标准溶液加入试样后，按2.5.1节提供的方法处理制备样品溶液，以考察前处理对回收率的影响。结果见表1。

表1 三种物质回收率试验结果

3.4 精密度测定

利用2.5.1设定条件测定一个鸡肉样品中三种核苷酸(5′-IMP、5′-GMP和AMP)的含量，测定5个平行，按2.4节设定条件进行高效液相色谱分析。对三种核苷酸的保留时间及含量的重现性进行分析，结果见表2。

4 讨论

利用建立的方法可较好的测定鸡肉中5′-肌苷酸、5′-鸟苷酸和腺苷酸三种核苷酸的含量。与以往的实验方法相比，此法利用磷酸盐缓冲液作为流动相，分离效果好。利用超声提取各种物质的效率高，结果平行性好。从精密度测定结果看出，5′-肌苷酸含量和保留时间相对标准偏差分别为0.165 6%和0.088 0%，5′-鸟苷酸含量和保留时间相对标准偏差分别为0.257 3%和0.065 0%，腺苷酸含量和保留时间相对偏差分别为0.279 4%和0.052 0%，三种核苷酸类物质的回收率测定结果在90.00%～108.00%，满足检测实验要求。以上结果表明该方法具有较好的精密度和较高的准确性，可用于大批量样品中三种鲜味核苷酸含量的测定。

5 结论

利用高效液相色谱建立的测定鸡肉中5′-肌苷酸(5′-IMP)、5′-鸟苷酸(5′-GMP)、腺苷酸(AMP)三种核苷酸含量的方法前处理简单、快速、定性定量准确、回收率较高、重现性好，达到了快速准确检测鸡肉中鲜味核苷酸含量的要求。