雷公藤多甙通过调控miR-146a表达来减轻LPS诱导的AR42J细胞炎症损伤

蒙振发 李以萍 谭德敏 陈绵军 陈军

(儋州市人民医院 1重症医学科，海南 儋州 571700；2门诊药房)

急性胰腺炎(AP)是临床上常见的急性腹症，临床一般表现为腹痛、恶心呕吐、发热、血胰酶升高等症状，具有起病迅速、病死率高、预后差等特点，除胰腺本身病变外，还可引发其他组织和器官损伤，甚至诱发患者全身性炎症反应和器官功能性障碍〔1～3〕。脂多糖(LPS)即热源或内毒素，是革兰阴性菌细胞壁的成分，具有毒性、炎症损伤作用，能诱发机体的免疫反应。雷公藤多甙(TWP)是卫矛科植物雷公藤去皮根中提取而成的总皂苷，其中二萜类化合物和雷公藤甲素发挥主要作用，临床上应用于免疫调控、抗炎、肾病等，其不良反应少、用量小，是目前国内外研究免疫调节、抗炎药的热点之一〔4〕。微小RNA(miRNA)是内源性非编码RNA，在炎症、免疫调节方面发挥着重要作用，大部分miRNA通过抑制基因表达，发挥负反馈调节作用，miR-146是最先发现在免疫应答中具有正反馈调节作用的miRNA，有miR-146a和miR-146b两个成员〔5〕。miR-146b在炎症反应中已被广泛研究报道，因此本研究以胰腺腺泡细胞(AR42J)为模型细胞，拟通过研究TWP在减轻LPS诱导的AR42J炎症损伤中的作用及对miR-146a表达的影响。

1 材料与方法

1.1试剂和仪器 TWP(≥98%)购自湖北恒景瑞化工有限公司；地塞米松(DXM) 磷酸钠注射液购自湖北天药药业股份有限公司(1 ml∶5 mg)；LPS(≥99%)购自上海酶联生物科技有限公司；DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibico公司；青链霉素双抗、四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂购自美国Hyclone公司；肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6和IL-1β酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购自美国Neomarker公司；总RNA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；U6内参(E021010)购自美国EARTHOX公司；miR-146a PCR引物(CD106)购自北京天根生化科技有限公司；兔抗鼠NF-κB p65、兔抗鼠Toll样受体(TLR)4、兔抗鼠内参β-Actin、羊抗兔二抗购自美国Bioworld公司；CFX96型实时荧光定量(RT-qPCR)仪购自美国BIO-RAD公司；Multiskan FC酶标仪、赛默飞世尔BB15 CO2细胞培养箱购自美国赛默飞公司；细胞培养接种专用超净台购自郑州安晟科学仪器有限公司；电泳槽和转膜槽购自美国Bio-Rad公司。

1.2细胞系 大鼠胰腺腺泡细胞(AR42J)购自中科院上海细胞库，加入含10%胎牛血清、1%青链霉素双抗的DMEM培养液，置于37℃ 5%CO2培养箱中常规培养，隔天换液。细胞生长至70%～80%融合后进行传代。收集对数生长期细胞进行后续试验。

1.3MTT法测定不同浓度TWP对AR42J细胞活性的影响 取对数生长期的AR42J细胞，用培养液将细胞密度调整为4×104个/ml，以每孔200 μl接种到96孔板，继续培养过夜后弃培养液，并用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3遍，加入含不同浓度的TWP培养液(终浓度分别为2、5、10、25、50、100 μmol/L)，每组设置6个复孔，同时设置不加TWP的对照组，只加0.1%二甲基亚砜(DMSO)组。培养箱培养24 h，之后加入25 μl 5 mg/ml的MTT溶液，继续培养4 h，弃去培养基，加入150 μl DMSO溶液，100 r/min 37℃震荡10 min，使用全自动酶标仪测定在490 nm处吸光度(OD值)。计算不同浓度TWP对AR42J细胞活性。细胞活性按下式计算：细胞活性(%)=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.4LPS刺激后AR42J细胞形态学观察 实验分组，对照组：不经任何处理的AR42J细胞；LPS组：加入2 ml 终浓度为10 μg/ml LPS培养液〔6〕；L-TWP+LPS组：加入2 ml终浓度为10 μg/ml LPS和2 μmol/L TWP培养液(LPS加入24 h后，再加入TWP培养24 h，以下分组操作与此相同)；M-TWP+LPS组：加入2 ml终浓度为10 μg/ml LPS和5 μmol/L TWP培养液；H-TWP+LPS组：加入2 ml终浓度为10 μg/ml LPS和10 μmol/L TWP培养液；DXM+LPS组：加入2 ml终浓度为10 μg/ml LPS和25 μg/mL DXM培养液〔7〕。将AR42J细胞接种到含有细胞爬片的6孔板上，培养24 h后，按照上面分组进行加药操作，待培养结束后染色、封片，用激光共聚焦观察细胞形态并拍照。

1.5ELISA检测TNF-α和IL-6表达水平 ELISA法检测细胞上清液中TNF-α和IL-6表达水平，将各孔的细胞培养基在4℃ 5 000 r/min离心半径10 cm条件下离心10 min，用移液器取上清液，严格按照ELISA试剂盒说明书操作测定各组细胞TNF-α和IL-6表达水平，显色后，用多功能酶标仪测定样品在450 nm处的吸光度，根据建立的标准曲线计算TNF-α和IL-6浓度。

1.6RT-qPCR检测细胞中miR-164a表达水平 收集AR42J细胞，实验分组同“1.4”，使用总RNA提取试剂盒提取AR42J细胞中的总RNA，经过反转录得cDNA，采用RT-qPCR仪对miR-164a进行扩增。RT-qPCR体系共20.0 μl，其中SYBR Mix10.0 μl，cDNA(25 ng/ml) 2.0 μl，上下游引物(5 μmol/L)各2.0 μl，ddH2O 4.0 μl。反应条件：95℃预变性300 s，95℃变性30 s，63℃退火30 s，73℃延伸15 s，40个循环后，73℃终末延伸5 min。miR-164a上游引物:5′-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3′，下游引物：5′-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU-3′；U6上游引物:5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。每个样本均做3个副孔，采用2-ΔΔCt法对AR42J细胞miR-164a表达水平进行定量分析。

1.7Western印迹法测定TWP对AR42J细胞TLR4/核转录因子(NF)-κB信号通路的影响 Western印迹测定胶质瘤AR42J细胞NF-κB p65和TLR4表达情况，实验分组同“1.4”。用细胞裂解液十二烷基硫酸钠(SDS)提取各组细胞总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法测定各组细胞蛋白含量，每组设置6个副孔，40 μg蛋白加入到点样孔中，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离目标蛋白，根据目标蛋白大小剪切大小适当的凝胶。用湿转法将凝胶上蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%的脱脂奶粉封闭结合位点2 h。加入兔抗鼠NF-κB p65(1∶1 000)、兔抗鼠TLR4(1∶1 000)、兔抗鼠内参β-Actin(1∶1 000)4℃孵育过夜，用PBS清洗3次，每次5 min，加入羊抗兔二抗(1∶1 000)，25℃孵育15 min，PBS清洗3次，每次5 min，用显色剂电化学发光(ECL)显色、曝光。用凝胶成像设备观察。

1.8统计学分析 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1不同浓度TWP对AR42J细胞活性的影响 0 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L TWP处理24 h后AR42J细胞活性，分别为：(102.67±3.31)%、(98.46±4.27)%、(94.27±3.64)、(87.59±4.06)%、(76.91±4.16)%、(52.47±3.94)%、(32.65±3.92)%。AR42J细胞经10 μmol/L TWP处理24 h后，仍保持较高活性，为保证实验结果准确性，后续实验选取TWP浓度2 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L进行。

2.2LPS刺激后AR42J细胞形态 AR42J细胞经LPS诱导后，细胞逐渐变形、皱缩、边缘不规则、核仁不清晰，经不同浓度TWP处理后，随着浓度增加细胞形态逐步恢复，细胞逐渐恢复圆整饱满。见图1。

图1 LPS刺激后AR42J细胞形态(免疫荧光染色，×100)

2.3TWP对AR42J细胞促炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β表达的影响 与对照组相比，LPS组TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与LPS组相比，L-TWP+LPS组、M-TWP+LPS组、H-TWP+LPS组TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，随着TWP浓度升高，蛋白表达水平也随之降低，任意两组相比差异有统计学意义(P<0.05)。DXM+LPS组TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达水平与LPS组、L-TWP+LPS组及M-TWP+LPS组相比显著降低(P<0.05)，与H-TWP+LPS组相比差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.4TWP对AR42J细胞中miR-146a水平的影响 与对照组相比，LPS组miR-146a表达水平显著升高(P<0.05)。与LPS组相比，L-TWP+LPS组、M-TWP+LPS组、H-TWP+LPS组miR-146a表达水平显著升高(P<0.05)，随着TWP浓度升高，miR-146a表达水平也随之升高，任意两组相比差异有统计学意义(P<0.05)。DXM+LPS组miR-146a表达水平与LPS组、L-TWP+LPS组及M-TWP+LPS组相比显著升高(P<0.05)，与H-TWP+LPS组相比差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.5TWP对AR42J细胞TLR4/NF-κB信号通路的影响 与对照组相比，LPS组NF-κB p65蛋白、TLR4蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与LPS组相比，L-TWP+LPS组、M-TWP+LPS组、H-TWP+LPS组NF-κB p65蛋白、TLR4蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，随着TWP浓度升高，TNF-κB p65蛋白、TLR4蛋白表达水平也随之降低，任意两组相比差异有统计学意义(P<0.05)。DXM+LPS组NF-κB p65蛋白、TLR4蛋白表达水平与LPS组、L-TWP+LPS组及M-TWP+LPS组相比显著降低(P<0.05)，与H-TWP+LPS组相比差异无统计学意义(P>0.05)，见表1和图2。

表1 TWP对AR42J细胞TNF-α、IL-6、IL-1β表达及miR-146a、NF-κB p65、TLR4水平的影响

3 讨 论

p38MAPK和核转录因子NF-κB是胰腺炎发病中产生促炎症因子的主要途径，有学者认为肠黏膜受损，导致肠道菌群细胞壁成分LPS刺激机体是胰腺炎发病的主要原因〔8,9〕。研究表明LPS可激活机体免疫系统分泌大量炎症因子，从而引起炎症损伤，在实验性胰腺炎模型中，LPS刺激后上调TNF-α和IL-6等促炎症因子的表达，而TNF-α和IL-6的上调以正反馈方式持续活化NF-κB通路，导致炎症反应得以持续和放大〔10,11〕。本实验细胞形态结果说明炎症细胞模型构造成功。

TWP因其保留雷公藤的抗炎、免疫调节作用，去除毒性部分，在临床上主要用于治疗类风湿关节炎、皮肌炎、肾脏疾病、红斑狼疮等疾病〔12〕。TNF-α由非免疫或免疫细胞分泌的细胞因子，可与前炎症因子共同启动早期炎症反应，并维持炎症。IL-6是多效能的细胞因子，在炎症和免疫调节中发挥着重要作用〔13,14〕。徐光标等〔15〕研究表明TWP能够下调糖尿病肾病患者炎症因子TNF-α和IL-6表达水平从而改善患者免疫失衡状态，恢复肾脏功能，减少尿蛋白生成；进一步细胞实验发现，TWP预处理可抑制LPS诱导的大鼠星形胶质细胞促炎症因子TNF-α和IL-6释放，说明TWP能够改善LPS诱导的星形胶质细胞炎性损伤。本研究结果说明TWP能下调AR42J细胞促炎症因子TNF-α、TNF-α和IL-1β的表达，减轻LPS所致AR42J细胞炎症反应。

miRNA是目前生命科学研究的热点之一，可促进mRNA降解或抑制翻译，在转录水平上调控基因，最终影响下游蛋白分子的表达。研究表明miR-146a能够通过负反馈调节TNF受体相关因子(TRAF)6和IL-1受体相关激酶(IRAK)1，降低NF-κB活性，从而进一步降低下游促炎因子的表达〔16〕。本研究结果说明TWP能够上调炎症AR42J细胞miR-146a表达水平来减轻炎症损伤。周兴宏等〔17〕发现三七皂苷R1可能通过上调miR-146a表达水平，降低TNF-α和IL-6表达水平，以降低动脉粥样硬化小鼠血脂、血糖水平，并保护肝功能。随后研究〔18〕发现在PM1诱导的炎症BEAS-2B细胞中IL-6和IL-8表达水平上调，并通过激活NF-κB信号通路上调miR-146a的表达，过表达的miR-146a通过抑制IRAK1/TRAF6表达来阻止p65的核转位，并下调IL-6和IL-8的表达，说明miR-146a可以通过BEAS-2B细胞中的NF-κB信号传导途径负调节PM1诱导的炎症反应。本研究说明AR42J细胞经TWP处理后，TLR4/NF-κB信号通路受到抑制。

综上所述，TWP可能通过上调miR-146a表达水平抑制TLR4/NF-κB信号通路，降低炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达水平，从而减轻LPS诱导的AR42J细胞炎症损伤。