北沙参提取物(EEAR)通过miR-34a-5p/PEG10对肝癌细胞增殖凋亡的影响

金浩 余佳 王梓瑜 乔鸥 王军 韩江 李兆连

(1云南省第一人民医院，云南 昆明 650032；2昆明理工大学附属医院普通外科；3武汉大学人民医院肝胆外科)

肝癌是世界上常见的癌症之一，90%的肝细胞癌发生于肝硬化〔1〕。肝细胞癌主要采用外科(切除、肝移植)、局部(消融和栓塞治疗)等治疗方法〔2〕，但是肝癌复发率高，导致患者生存期短、生存质量较差，晚期肝癌患者通常采用中药综合治疗，改善患者生存质量，延长生存期〔3〕。研究中药抑癌的机制，成为基础研究的热点。

北沙参是伞形科珊瑚菜的干燥根，有养阴清肺、益胃生津之功效,主要用于肺热，燥咳，劳嗽痰血，热病津伤口渴〔4〕。研究发现北沙参提取物对肝癌、肺癌细胞有一定的抑制作用〔5〕，其可抑制肺癌细胞增殖侵袭能力〔6〕，在肿瘤临床治疗上有一定的应用价值。遗传印记基因(PEG)10在大多数肝癌组织中特异性高表达，沉默PEG10表达可抑制肝癌细胞生长〔7〕。miR-34家族在细胞中参与调控细胞周期、诱导细胞凋亡、抑制细胞迁移等生物行为，其与肿瘤关系密切，且发现miR-34在肝癌细胞中下调表达〔8,9〕。miR34和PEG10在肝癌中都有很重要的作用，而北沙参提取物抑制肝癌的机制是否与前述两者有关，尚未可知。

本研究以北沙参提取物(EEAR)处理肝癌细胞，研究EEAR对肝癌细胞增殖和凋亡的影响及miR-34a-5p和PEG10在此机制中的作用。

1 材料与方法

1.1材料 人肝癌细胞系MHCC97-H购自ATCC；杜尔贝科改良伊格尔培养液(DMEM)高糖培养基和胎牛血清(FBS)购自Gibco公司，抗PEG10抗体和抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体购自Abcam公司；胰蛋白酶Trypsin、四甲基偶氮唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma-Aldrich公司；Total RNA提取试剂盒、Real-time PCR 试剂盒、反转录试剂盒(RT-PCR)购自美国Invitrogen公司；双荧光素酶报告系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System)购自美国Promega公司；流式法细胞凋亡检测试剂盒、流式细胞仪购自美国BD公司，发光仪、全自动酶标仪及Real-time PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2细胞培养和药物处理 细胞培养：将MHCC97-H细胞接种于含10% FBS、1% 青-链霉素的DMEM高糖培养基中，于湿度95%、37℃ 5%CO2培养箱中常规培养，细胞培养至融合为一层时，Trysin消化，传代。

药物处理：北沙参提取物EEAR根据文献〔4〕的方法进行提取，用水溶解后配成不同浓度。待细胞培养至对数生长期时，收集细胞，稀释，以1×104个/孔接种于96孔板，培养24 h后，加入50 μl不同浓度(300.000、150.000、75.000、37.500、18.750、9.375 μg/ml)的北沙参提取物EEAR，对照用PBS代替EEAR，培养48 h，进行后续实验。

1.3细胞转染 收集对数生长期的MHCC97-H细胞，消化稀释，以每孔2×105个/孔接种于6孔板中，培养至细胞融合为一层时进行转染。先用无血清OptiMEM培养液稀释脂质体Lipofectamine2000和各组载体，取等体积脂质体和载体混合，室温孵育20 min，加入到培养好的细胞孔板中，培养6 h，换成高糖DMEM培养基，转染48 h，收集细胞，进行实验。

1.4Real-time PCR检测mRNA的表达 收集EEAR处理或转染48 h的各组MHCC97-H细胞，按照Total RNA提取试剂盒的说明书提取总RNA，然后按照反转录试剂盒说明书合成cDNA，以cDNA为模板按照Real-time PCR的说明书进行反应，反应程序为：95℃ 4 min；95℃ 30 s、58℃ 40 s、72℃ 35 s，40个循环；72℃ 10 min。miR-34a-5p 上游引物 5′-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT-3′，下游引物 5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；PEG10 上游引物 5′-AACAACAACAACAACTCCAAGC-3′，下游引物 5 ′-TCTGCACCTGGCTCTGCAG-3′;GAPDH 上游引物5′-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3′，下游引物5′-GGTCCACCACTGACACGTTG-3′。运用Bio-Rad PCR检测系统进行数据分析，经内参照GAPDH进行校正。

1.5MTT实验测定细胞生存率 收集培养至对数生长期的MHCC97-H细胞，接种于95-6微孔板，培养24 h，然后分别加入50 μl终浓度为75 μg/ml的EEAR后，再继续培养24 h、48 h、72 h，加入20 μl MTT溶液，继续培养4 h，小心弃去培养液，每孔加入150 μl DMSO，室温振荡5 min，酶标仪测定490 nm处的吸光度(A)值，生存率(%)=实验组A均值/control组A均值×100%。找出半数抑制浓度最佳条件。

1.6流式细胞术测定细胞凋亡率 各组MHCC97-H细胞经EEAR处理或转染后，接种于6孔板(2×104个细胞/孔)中，置于37℃ 5% CO2培养箱中培养72 h后弃去培养液，胰酶消化，收集细胞，按照膜联欢蛋白V异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)试剂盒说明书进行操作，加入 200 μl结合缓冲液重悬细胞，再加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI混匀，室温避光孵育20 min，用流式细胞仪测定细胞凋亡率。

1.7Western印迹检测蛋白表达 收集转染后经EEAR处理并培养48 h的各组MHCC97-H细胞，加入放射免疫沉淀裂解液(RIPA)，室温裂解20 min，冰浴超声破碎收集蛋白，测定蛋白浓度。进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜，脱脂奶粉室温封闭2 h，加入稀释的一抗(抗PEG10 1∶500)，4℃孵育过夜，洗膜2次，加入1 000倍稀释的二抗，室温孵育2 h，以GAPDH为内参照，分析蛋白表达水平。

1.8统计学处理 采用SPSS21.0软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1EEAR对肝癌细胞MHCC97-H中miR-34a-5p的表达及增殖、凋亡的影响 与Con组相比，EEAR组肝癌MHCC97-H细胞中miR-34a-5p表达量显著上升(P<0.05)，MHCC97-H细胞在48 h和72 h细胞增殖活性显著下降(P<0.05)，细胞凋亡率显著上升(P<0.05)，见图1、表1。

图1 EEAR对细胞 MHCC97-H、凋亡的影响

表1 EEAR对细胞MHCC97-H增殖、凋亡的影响

2.2miR-34a-5p过表达对肝癌细胞MHCC97-H增殖、凋亡的影响 与miR-NC组相比，miR-34a-5p组肝癌MHCC97-H细胞中miR-34a-5p表达量显著上升，MHCC97-H细胞在48 h和72 h细胞增殖活性显著下降，细胞凋亡率显著上升(P<0.05)，见表2、图2。

图2 miR-34-5p过表达对肝癌细胞MHCC-97H凋亡的影响

表2 miR-34-5p过表达对肝癌细胞MHCC-97H增殖、凋亡的影响

2.3抑制miR-34a-5p表达能逆转EEAR对肝癌细胞MHCC97-H增殖、凋亡的影响 与anti-miR-NC组相比，anti-miR-34a-5p组miR-34a-5p表达量显著下降(0.40±0.04 vs 0.13±0.02；t=18.112,P=0.000)。与Con组相比，EEAR组肝癌MHCC97-H细胞在48 h和72 h细胞增殖活性显著下降，细胞凋亡率显著上升(均P<0.05)；与anti-miR-NC+EEAR组相比，anti-miR-34a-5p+EEAR组肝癌MHCC97-H细胞在48 h和72 h细胞增殖活性显著上升，细胞凋亡率显著下降(均P<0.05)，见表3。

表3 抑制miR-34-5p表达能逆转EEAR对肝癌细胞MHCC-97H增殖、凋亡的影响

2.4miR-34a-5p靶向PEG10 通过Targetscan软件预测发现，PEG10的3′UTR序列中含有与miR-34a-5p互补的核苷酸序列，见图3。与miR-NC组相比，miR-34a-5p组野生型WT-PEG10的萤火虫荧光素酶相对活性显著下降(P<0.05)，而突变型MUT-PEG10的萤火虫萤光素酶相对活性没有明显变化。见表4。Western印迹结果发现，与miR-NC组(1.02±0.06)相比，miR-34a-5p组PEG10表达量显著下降(0.38±0.03，P<0.05)；与anti-miR-NC组(1.01±0.08)相比，anti-miR-34a-5p组PEG10表达量显著上升(1.92±0.12，P<0.05)，见图4。

图3 PEG10的3′UTR中含有与miR-34-5p互补的核苷酸序列

表4 双荧光素酶报告实验

1～4：miR-NC组，miR-34a-5p组，anti-miR-NC组，anti-miR-34a-5p组图4 miR-34a-5p调控PEG10的表达

2.5EEAR对PEG10表达的影响 与Con组相比，EEAR组PEG10 mRNA和蛋白表达量均显著下降(P<0.05)，见图5、表5。

表5 EEAR对PEG10表达的影响

图5 EEAR对PEG10表达的影响

2.6过表达PEG10可逆转EEAR对肝癌细胞MHCC97-H增殖、凋亡的影响 与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-PEG10组PEG10 mRNA表达量显著上升(0.98±0.08 vs 2.13±0.22，t=14.738,P=0.000)。与Con组相比，EEAR组MHCC97-H细胞增殖活性在48 h和72 h均显著下降，细胞凋亡率显著上升(均P<0.05)；与pcDNA3.1+EEAR组相比，pcDNA3.1-PEG10+EEAR组MHCC97-H细胞增殖活性在48 h和72 h均显著上升，细胞凋亡率显著下降(P<0.05)，见表6。

表6 过表达PEG10能逆转EEAR对细胞MHCC-97H增殖、凋亡的影响

3 讨 论

肝癌的主要病因是HBV、HCV感染、黄曲霉毒素、蓝藻毒素、吸烟、饮酒、肥胖、糖尿病和代谢综合征等，术后5年复发率高，5年相对生存率仅为12.1%〔10〕。2015年我国肝癌发病约46.6万人，死亡42.2万人〔11〕。中药是肝癌治疗中的重要组成部分，中药抑制肝癌细胞增殖、抗肝癌复发和转移等机制研究也取得很大进展〔12〕。

近年来研究发现，北沙参提取物具有抗肿瘤作用〔13,14〕。Cruz等〔15〕研究发现，北沙参根提取物通过增加p21和p27的诱导作用，抑制CDK4和细胞周期蛋白D1表达，从而抑制乳腺癌MCF-7细胞在G1期的增殖。Wu等〔16〕研究表明，北沙参多糖通过下调增殖细胞核抗原的表达，抑制肺癌细胞A549的迁移、增殖，并诱导细胞凋亡。北沙参也可以抑制肝癌细胞增殖，诱导细胞分化〔17〕。本研究发现，北沙参提取物EEAR能够抑制肝癌MHCC-97H细胞增殖，促进癌细胞凋亡，证实了北沙参提取物EEAR的肿瘤抑制作用。

miR-34包括miR-34a、miR-34b、miR-34c等成员，是p53的直接靶基因，miR-34的异位表达通常诱导细胞凋亡、细胞周期停滞或衰老，并通过E2F3、SIRT1与p53形成正反馈环路，不断增强与p53的作用〔18,19〕。Gao等〔20〕发现，miR-34a-5p在结直肠癌组织中表达下调，在p53野生型结肠癌细胞HCT116中过表达miR-34a-5p显著抑制了细胞的生长、迁移、侵袭和转移，而在敲除p53的细胞中则没有这种作用，说明miR-34a-5p通过p53的诱导使癌细胞凋亡和细胞周期停滞来抑制结直肠癌的复发。Pu等〔21〕发现，miR-34a-5p通过靶向酪氨酸激酶CD117促进骨肉瘤(OS)对多种药物的耐药性。Li等〔22〕发现，miR-34a-5p在肝细胞癌组织中表达下调，过表达miR-34a-5p可抑制肝癌细胞的增殖，促进癌细胞凋亡，降低对顺铂的耐药性，miR-34a-5p通过靶向AXL增强肝癌细胞对化疗的敏感性。本研究结果表明，北沙参提取物EEAR能够促进肝癌MHCC-97H细胞中miR-34a-5p表达，过表达miR-34a-5p可抑制MHCC-97H细胞增殖，促进细胞凋亡；抑制miR-34a-5p表达则可逆转EEAR对MHCC-97H细胞增殖、凋亡的影响，说明EEAR通过促进miR-34a-5p表达进而抑制肝癌。

PEG10位于人类染色体7q21.3上，是一种与肿瘤的增殖、凋亡和转移有关的癌基因，在多种肿瘤中呈现阳性表达〔23〕。Okabe等〔24〕通过全基因组cDNA微阵列发现，PEG10在大多数肝细胞癌组织中表达量显著上调，抑制PEG10表达可抑制肝癌细胞生长，过表达PEG10则降低了细胞凋亡介质SIAH1介导的细胞死亡。本研究发现，EEAR能够抑制MHCC97-H细胞中PEG10 mRNA和蛋白表达，过表达PEG10可逆转EEAR对MHCC-97H细胞增殖、凋亡的影响。说明EEAR通过抑制MHCC97-H细胞中PEG10的表达抑制肝癌。

另外，通过Targetscan软件预测发现，PEG10的3′UTR序列中含有与miR-34a-5p互补的核苷酸序列，说明两者可能存在结合位点或调控关系。通过双萤光素酶报告系统结果发现，miR-34-5p靶向负调控PEG10的表达，说明EEAR通过上调miR-34a-5p靶向抑制PEG10表达，进而抑制MHCC-97H细胞增殖，促进细胞凋亡。

本研究首次阐述了在肝癌MHCC97-H细胞中北沙参提取物EEAR通过miR-34a-5p抑制PEG10蛋白表达，从而抑制MHCC97-H细胞增殖，促进肝癌细胞凋亡。北沙参提取物对人肝癌具有潜在治疗作用，本研究为人肝癌的中药治疗提供了新的思路，对中药控制肝癌机制的基础研究具有重要意义。