不同剂量咪达唑仑通过上调miR-33a-5p抑制胶质瘤细胞的增殖、凋亡

赵利芳 杨建功

(新乡市中心医院麻醉与围术期医学科，河南 新乡 453000)

1 材料与方法

1.1材料 胶质瘤细胞SHG139和U87购自中国科学院上海细胞库；RPMI1640培养基购自美国Gibico公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京Solarbio公司；Trizol试剂、荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司；四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)试剂盒、凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2细胞培养与分组 胶质瘤细胞SHG139和U87用RPMI-1640培养基常规培养，分别用终浓度为0、15、30、60 μg/ml的Mida处理，作为Mida组，正常培养的细胞作空白对照(NC)组，将miR-con、miR-33a-5p转染至SHG139和U87细胞，记为miR-con组、miR-33a-5p组；将anti-miR-con和anti-miR-33a-5p分别转染至60 μg/ml Mida处理的SHG139和U87细胞中，记为Mida+anti-miR-con组、Mida+anti-miR-33a-5p组。

1.3实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-33a-5p和同源盒蛋白(Six)1 mRNA表达水平 提取各组细胞总RNA，反转录成cDNA，miR-33a-5p和Six1分别以U6和β-actin为内参进行PCR扩增，相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.4Western印迹检测Six1、增殖细胞核抗原(PCNA)和裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase)-3的表达 提取各组总蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜，5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h，加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育过夜，加入二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，曝光显影，定影，分析蛋白条带的吸光度，计算蛋白表达水平。

1.5MTT检测细胞活性 各组细胞培养48 h，按试剂盒说明书操作，酶标仪检测570 nm处吸光度(OD)值。细胞活性(%)=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.6克隆形成实验检测细胞克隆形成能力 将转染后的各组SHG139、U87细胞以每孔200个细胞接种于6孔板，每隔2 d换液1次，并观察细胞形态，克隆形成以绝大多数单个细胞数大于50为止。克隆形成后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，再用4%的多聚甲醛室温固定30 min，吸去固定液用吉姆萨染液染色10 min，水洗风干后，显微镜观察下拍照计数。

1.7流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组细胞，依据试剂盒说明书操作，加入Annexin V-FITC和PI避光孵育，最后上流式细胞仪检测。

1.8荧光素酶报告基因检测实验检测miR-33a-5p对Six1的靶向调控 构建Six1的3′UTR荧光素酶野生型和突变型载体(WT-Six1和MUT-Six1)，将其分别与miR-con和miR-33a-5p共转染至SHG139和U87细胞中，依据说明书要求，检测荧光素酶活性。

1.9统计学方法 采用SPSS20.00软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1不同剂量的Mida对胶质瘤细胞增殖的影响 随Mida浓度升高，胶质瘤细胞SHG139和U87的细胞活性降低，细胞克隆形成能力也降低，PCNA蛋白表达水平降低，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1、表1。

1～4:Mida 0.0 μg/ml组、Mida 15.0 μg/ml组、Mida 30.0 μg/ml组、Mida 60.0 μg/ml组；图3、图4同图1 Western印迹检测PCNA表达

表1 不同剂量的Mida对胶质瘤细胞活性和克隆形成的影响

2.2不同剂量的Mida对胶质瘤细胞凋亡的影响 随着Mida浓度升高，胶质瘤细胞SHG139和U87的凋亡率升高，Cleaved-caspase-3蛋白表达水平升高，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2，表2，图3。

图2 流式细胞术检测胶质瘤细胞凋亡率

表2 不同剂量的Mida对胶质瘤细胞凋亡的影响

图3 Western印迹检测Cleaved caspase-3表达

2.3不同剂量的Mida对胶质瘤细胞对miR-33a-5p和Six1表达的影响 随着Mida浓度升高，胶质瘤细胞SHG139和U87中miR-33a-5p表达水平升高，Six1 mRNA和蛋白表达水平降低，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4、表3。

图4 Western印迹检测Six1蛋白表达

表3 不同剂量Mida对胶质瘤细胞对miR-33a-5p 和Six1 表达的影响

2.4miR-33a-5p靶向调控Six1 TargetScan预测到Six1与miR-33a-5p存在结合位点(图5)。WT-Six1与miR-33a-5p组共转染后胶质瘤细胞SHG139和U87的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。见表4。miR-33a-5p组Six1表达水平显著低于miR-con组；anti-miR-33a-5p组Six1表达水平显著高于anti-miR-con组(P<0.05)。见图6、表5。

图5 miR-33a-5p与Six1 3′UTR的靶向序列

表4 荧光素酶实验验证miR-33a-5p 靶向调控

1～4：miR-con组、miR-33a-5p组、anti-miR-con组、anti-miR-33a-5p组图6 miR-33a-5p靶向调控Six1表达

表5 miR-33a-5p 调控Six1表达

2.5转染miR-33a-5p抑制胶质瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡 与miR-con组相比，miR-33a-5p组细胞活性和克隆形成能力降低，细胞凋亡率升高，Six1、PCNA蛋白表达水平降低，Cleaved-caspase-3蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图7、表6、表7。

1～3：NC组、miR-con组、miR-33a-5p组图7 Western印迹检测Six1、PCNA、Cleaved caspase-3蛋白表达

表6 转染miR-33a-5p 抑制胶质瘤SHG139细胞增殖和诱导细胞凋亡

表7 转染miR-33a-5p 抑制胶质瘤U87细胞增殖和诱导细胞凋亡

2.6干扰miR-33a-5p部分逆转Mida对胶质瘤细胞的抑制作用 与NC组相比，Mida组细胞活性和克隆形成能力降低，细胞凋亡率升高，Six1、PCNA表达水平降低，Cleaved-caspase-3表达水平升高(P<0.05)；与Mida+anti-miR-con组相比，Mida+anti-miR-33a-5p组细胞活性和克隆形成能力升高，细胞凋亡率降低，Six1、PCNA表达水平升高，Cleaved-caspase-3表达水平降低(P<0.05)。见表8、表9、图8。

表8 转染anti-miR-33a-5p部分逆转Mida抑制胶质瘤SHG139细胞增殖和诱导细胞凋亡

表9 转染anti-miR-33a-5p部分逆转Mida抑制胶质瘤U87细胞增殖和诱导细胞凋亡

1～4：NC组、Mida组、Mida+anti-miR-con组、Mida+anti-miR-33a-5p组图8 转染anti-miR-33a-5p部分逆转Mida抑制胶质瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡

3 讨 论

胶质瘤是成人神经系统恶性肿瘤，其高侵袭性、高复发性与不良预后相关，究报道mRNA可影响胶质瘤的进展〔10，11〕。研究报道上调miR-33a-5p表达通过调节雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号传导可抑制肺腺癌细胞的增殖和迁移，并增加细胞凋亡，还能增强对雷公藤红素的敏感性〔12〕。miR-33a通过调节β-连环蛋白(β-catenin)抑制肺癌细胞的增殖和侵袭〔13〕。本实验结果说明高表达miR-33a-5p可抑制胶质瘤的增殖，促进细胞凋亡。PCNA是DNA合成所必需的的核蛋白，可作为细胞增殖指标，有研究报道PCNA在脑胶质瘤细胞中表达增加〔14〕。Caspase-3是调控凋亡的核心蛋白酶，Cleaved caspase-3是Caspase-3活化过程中产生的，其表达可反映细胞凋亡〔15〕。本实验说明miR-33a-5p可抑制胶质瘤的增殖，促进细胞凋亡。Six1定位于14α23染色体，是大脑发育中的关键调节因子，也是上皮间质转化(EMT)中重要的转录因子，与肿瘤细胞的迁袭和转移有关〔16〕。有研究报道Six1在胶质瘤中高表达，与患者预后不良相关〔17〕。本实验提示miR-33a-5p可能通过Six1影响胶质瘤的增殖、凋亡。

肿瘤治疗除了手术切除，一些麻醉药也可有效抑制肿瘤活性。Mida是一种常用的麻醉药，研究发现Mida通过介导miRNA-520d调控STAT3通路，可诱导肺癌细胞凋亡〔4〕。Mida还可通过下调USP22抑制人结肠癌SW480细胞增殖〔18〕。此外，Mida可有效调节急性颅脑损伤患者免疫平衡、改善应激状态，保护脑组织〔19〕。本实验结果说明Mida可抑制胶质瘤细胞增殖、促进细胞凋亡，可能通过调控miR-33a-5p及Six1影响胶质瘤细胞的增殖和凋亡。

综上所述，Mida可抑制胶质瘤细胞增殖，促进细胞凋亡，其机制可能是与miR-33a-5p、Six1表达水平相关，将为胶质瘤的治疗提供新思路和新靶点。