半边莲提取物通过miR-20a-3p/FHIT调控结直肠癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭

杨传广 席作武 王凯 韩晓丽

(河南中医药大学 1第二临床医学院，河南 郑州 450000；2第二附属医院肛肠科)

结肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，我国结肠癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势。半边莲(LCL)是临床上常用的抗癌中药，用于治疗肝癌 、肺癌 、胃癌、直肠癌、食道癌、宫颈癌等多种癌症，其可抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡〔1，2〕。研究发现LCL提取物对胃癌、肝癌细胞增殖有一定的抑制作用，并且其可诱导肝癌细胞凋亡〔3〕，但目前LCL对结直肠癌的影响研究较少。研究发现miR-20a在直肠癌、肠炎相关结直肠癌中表达上调〔4〕。miR-20a-3p靶向含有4个mbt区域的scm相关基因(SFMBT1)影响角质形成细胞的增殖和凋亡〔5〕。脆性组氨酸三联体(FHIT)在结直肠癌中下调表达，其可能参与结直肠癌细胞凋亡的调节，并有研究证明过表达FHIT可抑制结直肠癌细胞增殖、侵袭活性〔6〕。本研究旨在探究LCL通过miR-20a-3p/FHIT对结直肠癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1材料 结直肠癌细胞SW480(上海生命科学院细胞库)；LCL(福建省中医药研究院)；胎牛血清(法国 Biowest公司)；DMEM培养基、青-链霉素双抗(美国Gibco公司)；miRNA 荧光定量试剂盒；RIPA裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒(美国Thermo scientificals公司)、Tranwell 小室(美国Millipore公司)；基质胶(美国BD公司)；LipofectamineTM2000转染试剂(美国invitrogen公司)；miR-con、miR-con mimic、anti-miR-NC、anti-miR-20a-3p、si-NC、si-FHIT的构建(上海吉凯基因公司)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(北京，天根生化科技有限公司)；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(美国 Sigma公司)；细胞周期蛋白(Cyclin)D1、B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、P21、Bcl-2相关X蛋白(Bax)一抗(美国Abcam公司)；上皮型钙粘蛋白(E-cadherin)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、β-肌动蛋白(actin)抗体(美国CST公司)；FHIT过表达载体及空载体(广州复能基因有限公司)；miR-20a-3p、FHIT引物(上海生工公司)；免疫球蛋白(Ig)G二抗(北京博奥森生物科技有限公司)。

1.2细胞的培养与分组 结直肠癌细胞SW480置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中贴壁培养。实验分为对照组(Con)、LCL组，LCL组：取对数期细胞添加LCL，各组终浓度为150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L〔2〕分别记作LCL 150 mg/L组、LCL 200mg/L组、LCL 250 mg/L组、LCL 300 mg/L组，Con与LCL组继续培养1 w进行后续检测，每组设置4个重复。

1.3miR-20a-3p抑制物及模拟物的转染 取对数生长期细胞3×105个接种于6孔板中，培养24 h后，使用LipofectamineTM2000转染试剂分别以miR-con、miR-20a-3p mimic、anti-miR-NC、anti-miR-20a-3p、si-NC、si-FHIT转染至不同孔SW480细胞，转染后以无双抗培养基培养，6 h后更换完全培养基，继续培养24 h进行后续实验，每组设置4个重复。

1.4实时荧光定量PCR(RT-qPCR) 收集生长状态良好的细胞约1×107个提取总RNA，反转录为cDNA进行RT-qPCR，RT-qPCR反应参数为95℃预变性2 min，95℃变性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40个循环。以U6和β-actin分别为miR-20a-3p、FHIT的内参基因，2-ΔΔct方法计算miR-20a-3p、FHIT的相对表达量，实验重复3次取平均值。引物序列：miR-20a-3p：正义链3′-ACTGCATTATGAGCACTTAAAG-5′，反义链5′-AAGTGCTCATAATGCAGT-3′；U6：正义链5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反义链5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；FHIT：正义链5′-ATCCTGGAAGCTTTGAAGCTCA-3′，反义链5′-TCACTGGTTGAAGAATACAGG-3′；β-actin：正义链5′-TCACCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反义链5′-CTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′ 。

1.5MTT法检测细胞增殖情况 终止培养前4 h每孔加入20 μl MTT继续培养，离心弃上清保留下层细胞，每孔加入100 μl二甲基亚砜(DMSO)，避光震荡孵育15 min，使结晶充分溶解，酶标仪检测490 nm波长的吸光值(OD值)。抑制率=〔1-(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)〕×100%。

1.6Transwell实验检测结直肠癌细胞SW480细胞的迁移和侵袭能力 上述加药处理、转染后细胞2×104个接种于Transwells小室，上层含基质胶，培养48 h后收集上层小室穿膜细胞于10 ml/L的多聚甲醛溶液，结晶紫溶液染色15 min，200倍光镜下随机选取5个视野统计穿膜细胞数，每组设置4个重复。

1.7双荧光素酶实验检测miR-20a-3p对FHIT的影响 构建野生型pGL3-FHIT-3′UTR(wt-FHIT 3′UTR)和突变型pGL3-FHIT-3′UTR(mut-pGL3-FHIT-3′UTR)表达载体，使用Lipofectamine TM2000转染试剂分别转染至miR-con、miR-20a-3p mimic SW480细胞，转染后48 h收集细胞，检测双荧光素酶活性，检测miR-20a-3p 对 FHIT 荧光活性的调控。

1.8采用蛋白印迹(WB)法检测蛋白表达情况 收集上述处理细胞，提取细胞中总蛋白，测定蛋白浓度；十二烷基硫酸钠(SDS)变性蛋白；电泳跑胶，湿转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，电化学发光(ECL)显影液显影，使用AI600成像系统观察、拍照，Image J软件进行灰度值分析，以β-actin为内参进行灰度值比较。

1.9流式细胞仪检测细胞凋亡 收集上述处理细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗；加入250 μl PBS重悬细胞，避光条件下加入10 μl Annexin V-FITC混匀，室温避光孵育15 min；然后加入5 μl PI混匀，孵育5 min，流式细胞仪检测细胞凋亡水平。

1.10统计学方法 采用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1LCL对结直肠癌细胞SW480增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响 与Con组比较，LCL各剂量组结直肠癌细胞SW480凋亡率、抑制率显著增加、CyclinD1、Bcl-2蛋白水平显著降低，P21、Bax蛋白水平显著升高(P<0.05)。见图1、图2、表1。

1～5：Con组、LDL 150 mg/L组、LDL 200 mg/L组、LDL 250 mg/L组、LDL 300 mg/L组图1 LCL对结直肠癌细胞SW480增殖、凋亡蛋白表达的影响

图2 LCL对结直肠癌细胞SW480凋亡的影响

表1 LCL对结直肠癌细胞SW480增殖、凋亡的影响

根据药物的IC50选择250 mg/L浓度做后续实验，Transwell实验检测显示，与Con组比较，LCL 250 mg/L组结直肠癌细胞SW480侵袭、迁移细胞数显著降低与Con组比较，LCL 250 mg/L组结直肠癌细胞SW480中E-cadherin蛋白水平显著升高，MMP-2蛋白水平显著降低。见表2、图3、图4。

表2 半边莲对结直肠癌细胞SW480迁移、侵袭的影响

图3 LCL对结直肠癌细胞SW480迁移、侵袭蛋白表达的影响

图4 LCL对结直肠癌细胞SW480迁移、侵袭的影响(结晶紫染色，×200)

2.2半边莲对结直肠癌细胞SW480中miR-20a-3p、FHIT表达的影响 与Con组比较，LCL 250 mg/L组SW480细胞的miR-20a-3p mRNA水平显著降低，FHIT的mRNA及蛋白水平显著升高(P<0.05)。见图5，表3。

图5 FHIT蛋白的表达

表3 半边莲对结直肠癌细胞SW480中miR-20a-3p、FHIT表达的影响

2.3抑制miR-20a-3p表达对结直肠癌细胞SW480增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响 与anti-miR-NC组比较，anti-miR-20a-3p组SW480细胞miR-20a-3p mRNA水平显著降低，CyclinD1、Bcl-2蛋白水平显著降低，P21、Bax蛋白水平显著升高，细胞抑制率、凋亡率显著升高(P<0.05)。见图6，表4；SW480细胞E-cadherin蛋白水平显著升高，MMP-2蛋白水平显著降低，细胞侵袭、迁移数显著降低。见图6，表4、5。

图6 抑制miR-20a-3p表达对结直肠癌细胞SW480增殖、凋亡、迁移、侵袭蛋白表达的影响

表4 抑制miR-20a-3p表达对结直肠癌细胞SW480增殖、凋亡的影响

表5 抑制miR-20a-3p表达对结直肠癌细胞SW480迁移、侵袭的影响

2.4过表达miR-20a-3p能逆转LCL对结直肠癌细胞SW480增殖、凋亡、迁移、侵袭的作用 与LCL 250 mg/L+miR-NC组比较，LCL 250 mg/L+miR-20a-3p组SW480细胞miR-20a-3p水平显著升高，CyclinD1、Bcl-2蛋白水平显著升高，P21、Bax蛋白水平显著降低，细胞抑制率、凋亡率显著降低(P<0.05)。与LCL 250 mg/L+miR-NC组比较，LCL 250 mg/L+miR-20a-3p组SW480细胞E-cadherin蛋白水平显著降低，MMP-2蛋白水平显著升高，细胞侵袭、转移数目显著升高(P<0.05)。见图7、表6。

1～4：Con组、LDL 250 mg/L组、LDL 250 mg/L+miR-NC组、LDL 250 mg/L+miR-20a-3p组图7 过表达miR-20a-3p能逆转LCL对结直肠癌细胞SW480增殖、凋亡、迁移、侵袭蛋白表达的影响

表6 过表达miR-20a-3p能逆转LCL对结直肠癌细胞SW480迁移、侵袭的作用

2.5miR-20a-3p靶向、调控FHIT TargetScan软件预测miR-20a-3p与FHIT 3′UTR存在结合位点(图8)，荧光素酶实验进一步验证miR-20a-3p与FHIT3′UTR的联系，WT-FHIT 3′UTR与miR-20a-3p mimic共转染组的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。与miR-NC组比较，miR-20a-3p组FHIT蛋白水平显著降低；与anti-miR-NC比较，anti-miR-20a-3p组FHIT蛋白水平显著升高。见图9，表7，表8。

图8 FHIT的3′UTR含有miR-20a-3p的互补序列

1～4:miR-NC组、miR-20a-3p组、anti-miR-NC组、anti-miR-20a-3p组图9 miR-20a-3p调控FHIT的表达

表7 双荧光素酶报告实验

表8 miR-20a-3p调控FHIT的表达

2.6抑制FHIT的表达能逆转LCL对结直肠癌细胞SW480增殖、凋亡、迁移、侵袭的作用 与LCL 250 mg/L+si-NC组比较，LCL 250 mg/L+si-FHIT组SW480细胞FHIT蛋白水平显著降低，CyclinD1、Bcl-2、MMP-2蛋白水平显著升高，P21、Bax、E-cadherin蛋白水平显著降低，细胞抑制率、凋亡率显著降低，迁移、侵袭细胞数显著增多(P<0.05)。见表1、图10、表9。

1～4：Con、LDL 250 mg/L、LDL 250 mg/L+si-NC、LDL 250 mg/L+si-FHIT图10 抑制FHIT的表达能逆转半边莲对结直肠癌细胞SW480增殖、凋亡、迁移、侵袭蛋白表达的影响

表9 抑制FHIT的表达能逆转半边莲对结直肠癌细胞SW480迁移、侵袭的作用

3 讨 论

LCL属桔梗科植物，其主要化学成分为生物碱、皂甙、黄酮甙等，生物碱具有消肿、清热解毒、抑癌功效〔7〕。目前研究报道，LCL对肺癌细胞、Hela细胞、胃癌细胞、肝癌细胞具有抑制作用，LCL通过抑制胃癌BG-38细胞增殖，抑制肿瘤的发展；LCL通过影响细胞内钙信号稳态失衡诱导肝癌HepG2细胞凋亡〔8，9〕。本研究中，不同浓度LCL处理结直肠癌SW480细胞，结果显示，LCL能够促进SW480细胞的凋亡，抑制增殖、迁移和侵袭，提示LCL可在结直肠癌SW480细胞中发挥抑癌作用，可为临床治疗提供理论依据。

研究发现miR-20a在直肠癌、结直肠癌中表达上调〔10〕，miR-20a的高表达能够反映结直肠癌的发生和进展以及评估患者的预后〔11〕。miR-20a-5p在胃癌组织中随着胃癌恶性程度的增加而降低，与肿瘤的侵袭、转移相关，降低miR-20a-5p的表达，可抑制胃癌的进一步发展〔12〕。Xiong等〔13〕研究报道，miR-20a在甲状腺癌细胞中高表达，可通过抑制miR-20a的表达，抑制良性甲状腺癌的恶化。本研究提示LCL 可能通过抑制miR-20a-3p的表达，抑制结肠癌SW480细胞的增殖、侵袭、转移。

Bcl-2为抗凋亡蛋白，Bax为促凋亡蛋白，细胞中Bax与Bcl-2结合形成异二聚体，当Bax表达过量可抑制Bcl-2的凋亡抑制作用促进细胞凋亡〔14〕。基底膜中的MMP-2的表达活性升高可降解基底膜中的Ⅳ型胶原，促进癌细胞的侵袭和转移〔15〕。CyclinD1调控细胞增殖周期的G1-S过程，其在正常组织中不表达或者低表达，在恶性肿瘤组织中高表达〔16〕。P21是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂家族重要成员，可抑制CyclinD1的表达，发挥抑癌基因作用。Cadherin是一种钙黏附蛋白，参与细胞间的黏附，其表达水平升高，抑制细胞的迁移、侵袭〔17〕。为进一步验证miR-20a-3p对SW480细胞的影响，本研究进行抑制、过表达miR-20a-3p实验，结果显示抑制miR-20a-3p后，CyclinD1、Bcl-2、MMP-2蛋白水平显著降低，P21、Bax、E-cadherin蛋白水平显著升高，细胞抑制率、凋亡率显著升高，侵袭、迁移细胞数显著降低；过表达miR-20a-3p后，SW480细胞CyclinD1、Bcl-2、MMP-2蛋白水平显著升高，P21、Bax、E-cadherin蛋白水平显著降低，细胞抑制率、凋亡率显著降低，侵袭、转移数目显著升高，进一步验证了LCL通过miR-20a-3p的表达发挥对结肠癌SW480细胞的促凋亡作用。

本研究提示miR-20a-3p可靶向负调控FHIT的表达，miR-20a-3p。FHIT是定位于人3号染色体短臂3P14.2区，是组氨酸三联体家族成员之一〔18〕。FHIT可通过上调P21的表达，阻滞细胞周期，抑制细胞的增殖。FHIT基因在食管癌、结直肠癌、胃癌组织中呈显著低表达〔19〕。研究报道，将FHIT基因导入到结肠癌细胞系中，可明显抑制肿瘤细胞的增殖活性和侵袭力〔20〕。本研究中LCL可促进细胞的凋亡，抑制增殖、迁移与侵袭，抑制FHIT基因后，SW480细胞Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2蛋白水平显著升高，P21、Bax、E-cadherin蛋白水平显著降低，细胞抑制率、凋亡率显著降低，迁移、侵袭细胞数显著增多，提示抑制FHIT基因可逆转LCL的促凋亡、抑制增殖、迁移、侵袭作用。从机制上讲LCL可能通过物通过miR-20a-3p/FHIT促进结直肠癌细胞凋亡，抑制其增殖、迁移、侵袭。

综上所述，本文初步探讨了LCL通过miR-20a-3p/FHIT促进结直肠癌细胞凋亡，抑制其增殖、迁移、侵袭的机制，为肝癌分子靶向治疗提供理论依据。