DLEU2靶向miR-30d-5p影响舌鳞癌细胞增殖和凋亡的分子机制

付娟 李娜 袁清敏

(1河南护理职业学院口腔医学系，河南 安阳 455000；2安阳市口腔医院修复科)

舌鳞状细胞癌(TSCC)属于头颈部恶性肿瘤之一，其具有恶性程度高、高复发转移率等病理特征，由于其具有较强的侵袭性导致患者预后不良，严重时还可能出现局部扩散及远处转移等〔1，2〕。因而积极探寻TSCC发生机制对早期诊断及改善患者预后均具有重要临床意义。长链非编码RNA(LncRNA)是一种长度超过200 nt的非编码RNA分子，研究表明LncRNA表达异常与TSCC细胞增殖密切相关，并可能作为TSCC生物标志物及靶向治疗靶点〔3〕。相关研究用芯片分析法获得TSCC细胞癌组织和正常舌组织中差异表达的LncRNA，结果发现LncRNA DLEU2在TSCC细胞中下调表达〔4〕。研究表明DLEU2在宫颈癌组织及细胞中下调表达，过表达DLEU2可抑制癌细胞增殖、迁移能力〔5〕。DLEU2还可通过调控miR-16-1信号通路而影响喉癌细胞迁移、侵袭能力〔6〕。但DLEU2对TSCC细胞生物行为的影响及其机制目前还不清楚。研究表明TSCC组织中微小RNA-30d-5p(miR-30d-5p)的表达量显著高于癌旁组织，且miR-30d-5p的表达量与患者TNM分期、分化程度和颈淋巴结转移有关，抑制miR-30d-5p表达可有效抑制TSCC细胞增殖、迁移、侵袭能力〔7〕。通过生物信息学软件预测到miR-30d-5p可能是DLEU2作用的靶基因，DLEU2是否可通过调控miR-30d-5p表达进而参与TSCC发生及发展过程尚未可知。因此本研究对TSCC组织中DLEU2的表达进行分析，构建DLEU2过表达载体上调TSCC Tca8113细胞中DLEU2的表达，探讨其对TSCC细胞增殖及凋亡的影响，并分析其对miR-30d-5p的调控作用，以期为TSCC早期诊断及靶向治疗奠定理论基础。

1 资料与方法

1.1一般资料

1.1.1实验对象 选取2015年3月至2016年4月安阳市口腔医院修复科收治的TSCC患者26例为研究对象，所有患者经手术病理证实为TSCC，男15例，女11例，年龄为60～70岁，平均为(65.32±3.26)岁，收集患者临床病理资料，TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期11例，Ⅲ～Ⅳ期15例；分化程度：低分化10例，中分化6例，高分化10例；淋巴结转移10例，未发生淋巴结转移16例。纳入标准：所有患者术前未接受放疗或化疗；临床资料完整。排除标准：合并其他恶性肿瘤；既往手术史者；患有严重代谢性疾病者。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者及家属知情且签署同意书。于术中切取TSCC组织及其癌旁组织(>5 cm)，迅速放于液氮中，术后将组织标本存放于-80℃超低温冰箱保存。

1.1.2材料与试剂 TSCC细胞Tca8113购自中国科学院细胞库。RPMI1640培养基、胰蛋白酶-EDTA、Lipofectamine2000转染试剂均购自美国Invitrogen公司；胎牛血清、青霉素-链霉素混合溶液均购自美国Hyclone公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒与实时荧光定量-聚合酶链反应(PCR)试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司；miR-30d-5p mimics及其阴性对照序列均购自上海博亚生物技术有限公司；pcDNA3.1与si-DLEU2及其阴性对照均购自广州锐博生物科技有限公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂购自美国Sigma公司；细胞凋亡检测试剂盒购自华阜康生物科技股份有限公司；B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关x蛋白(Bax)、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21抗体均购自美国CST公司；双荧光素酶报告基因检测系统购自美国Progema公司；细胞裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度检测试剂盒与电化学(ECL)发光液均购自中国碧云天生物技术研究所；辣根过氧化物酶(HRP)标记的IgG二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养、转染及分组 将TSCC Tca8113细胞置于含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基，放入含有5%CO2的37℃恒温培养箱进行培养，当细胞融合度达80%左右时用胰蛋白酶消化细胞进行传代培养。取对数生长期细胞，使用Lipofectamine2000转染试剂盒进行转染，根据转染物不同对Tca8113细胞进行分组：pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1序列)；pcDNA3.1-DLEU2组(转染DLEU2过表达载体)；si-DLEU2组(转染DLEU小干扰RNA序列)；si-NC组(转染DLEU阴性对照序列)；pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC组(共转染DLEU2过表达质粒与miR-30d-5p阴性对照)；pcDNA3.1-DLEU2+miR-30d-5p组(共转染DLEU2过表达质粒与miR-30d-5p mimics)。转染6 h后将培养基更换为含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基，放入含有5%CO2的37℃恒温培养箱继续培养48 h。

1.2.2qRT-PCR检测DLEU2、miR-30d-5p的表达 取冻存TSCC组织及癌旁组织标本，剪碎后研磨，加入细胞裂解液，冰上裂解30 min，使用RNA提取试剂盒提取组织总RNA。细胞RNA提取方法：收集各组转染后TSCC Tca8113细胞，用胰蛋白酶消化后加入细胞裂解液，冰上裂解30 min后提取细胞总RNA。核酸微量检测仪检测RNA浓度与纯度，参照反转录试剂盒将RNA合成cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR反应，反应条件为95℃ 5min循环1次，95℃ 30 s循环38次，60℃ 30 s循环38次，72℃ 30 s循环38次。每个样品均设置3个复孔，采用2-ΔΔCt法计算DLEU2、miR-30d-5p的相对表达量。

1.2.3MTT比色法检测细胞增殖 取转染后各组Tca8113细胞，胰蛋白酶消化细胞，制备细胞悬浮液，调整细胞密度至3×105个/ml，以每孔1×105个细胞的密度接种于96孔板，分别于培养24 h、48 h、72 h时各孔分别加入浓度为5 mg/ml的MTT溶液20 μl，室温孵育4 h，弃上清，分别加入150 μl DMSO溶液，振荡10 min，放入酶标仪检测各孔光密度值(OD)，检测波长为490 nm，每组均设置3次重复。

1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡率 收集各组对数生长期Tca8113细胞，预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，胰蛋白酶消化细胞，调整细胞密度为1×105个/ml，以每孔1×105个细胞的密度接种于6孔板，加入100 μl结合缓冲液重悬细胞，分别加入5 μl浓度为250 ng/L的膜联蛋白(Annexin)V-异硫氰酸荧光素(FITC)与浓度为250 ng/L的碘化丙啶(PI)5 μl，室温避光孵育20 min，加入400 μl结合缓冲液，于1 h内在流式细胞仪上检测细胞凋亡率。

1.2.5Western印迹检测CyclinD1、p21、Bax、Bcl-2蛋白表达 取转染后各组Tca8113细胞，预冷PBS洗涤细胞，加入100 μl细胞裂解液，4℃条件下裂解30 min，4℃条件下12 000 r/min转速离心10 min提取蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度，以每泳道30 μg总蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)反应，将分离的蛋白凝胶转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入蛋白一抗(1∶1 000)，置于摇床孵育24 h(温度为4℃)，TBST洗膜后再与二抗(1∶2 000)室温下孵育1 h，TBST洗膜，ECL显影，用凝胶成像系统及Quantityone软件检测条带灰度值。

1.2.6双荧光素酶报告基因实验 利用在线数据库预测DLEU2的3′UTR存在miR-30d-5p的结合位点，用PCR将DLEU2与miR-30d-5p的结合位点序列进行克隆，构建重组荧光素酶报告基因质粒pGL3-DLEU2-3′UTR(WT-DLEU2)；将DLEU2中预测结合片段改变，构建pGL3-DLEU2-3′UTR-mut(MUT-DLEU2)突变体报告载体，用双酶切电泳鉴定构建载体。参照Lipofectamine2000转染试剂将WT-DLEU2、MUT-DLEU2报告载体与miR-30d-5p mimics或阴性对照共转染至TSCC Tca8113细胞，转染48 h后根据荧光素酶检测试剂盒检测细胞荧光素酶活性。

1.3统计学处理 采用SPSS19.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1DLEU2在TSCC组织和对应癌旁组织中的表达 DLEU2在TSCC组织中的表达水平(0.27±0.02)较癌旁组织(0.82±0.08)明显降低(P<0.05)。

2.2过表达DLEU2对TSCC细胞Tca8113增殖的影响 与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-DLEU2组Tca8113细胞中DLEU2表达水平明显升高(P<0.05)，提示转染效率良好。过表达DLEU2可显著降低细胞增殖活性(P<0.05)，表明DLEU2过表达可明显抑制TSCC细胞增殖。与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-DLEU2组ca8113细胞中CyclinD1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，p21蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，表明DLEU2过表达可通过抑制CyclinD1蛋白表达及促进p21蛋白表达进而抑制TSCC细胞增殖。见图1，表1。

图1 Western印迹检测过表达DLEU2对TSCC细胞Tca8113增殖蛋白表达的影响

表1 过表达DLEU2对TSCC细胞Tca8113增殖的影响

2.3过表达DLEU2对TSCC细胞Tca8113凋亡的影响 与pcDNA3.1组比较，过表达DLEU2后TSCC Tca8113细胞凋亡率明显增加(P<0.05)，表明DLEU2过表达可促进TSCC细胞凋亡。pcDNA3.1-DLEU2组TSCC Tca8113细胞中Bax表达水平较pcDNA3.1组显著升高(P<0.05)，而Bcl-2表达水平显著降低(P<0.05)。表明DLEU2过表达可通过促进Bax表达及抑制Bcl-2表达进而促进TSCC细胞凋亡。见图2、图3、表2。

图2 过表达DLEU2对TSCC细胞Tca8113凋亡的影响

图3 Western印迹检测过表达DLEU2对TSCC细胞Tca8113凋亡蛋白表达的影响

表2 过表达DLEU2对TSCC细胞Tca8113凋亡的影响

2.4DLEU2靶向、调控miR-30d-5p 生物信息学方法检测得出miR-30d-5p可能是DLEU2的直接作用靶点，见图4。通过双荧光素酶报告基因实验分析可知，与miR-NC组比较，miR-30d-5p过表达可明显降低WT-DLEU2野生型组细胞荧光素酶活性(P<0.05)；而MUT-DLEU2突变型组miR-30d-5p过表达后细胞荧光素酶活性与阴性对照相比无明显变化(P>0.05)，见表3。表明DLEU2能够结合miR-30d-5p而影响其活性。转染si-DLEU2的Tca8113细胞中miR-30d-5p表达水平(1.17±0.10)显著高于转染si-NC(0.88±0.09，P<0.05)，而转染pcDNA3.1-DLEU2后miR-30d-5p的表达(0.53±0.05)明显降低(P<0.05)。表明DLEU2可通过吸附miR-30d-5p而负向调节其表达。

图4 DLEU2靶向miR-30d-5p

表3 双荧光素酶报告实验

2.5过表达miR-30d-5p能逆转DLEU2对TSCC细胞Tca8113增殖的影响 共转染pcDNA3.1-DLEU2与miR-30d-5p mimics后Tca8113细胞增殖活性较pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC组明显升高(P<0.05)，促进CyclinD1表达(P<0.05)，明显抑制p21表达(P<0.05)。表明过表达miR-30d-5p可逆转DLEU2对TSCC细胞Tca8113增殖的抑制作用。见图5，表4。

1～2：pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC组、pcDNA3.1-DLEU2+miR-30d-5p组，下图同图5 过表达miR-30d-5p能逆转DLEU2对TSCC细胞Tca8113增殖蛋白表达的影响

表4 过表达miR-30d-5p能逆转DLEU2对TSCC细胞Tca8113增殖的影响

2.6过表达miR-30d-5p能逆转DLEU2对TSCC细胞Tca8113凋亡的影响 相较于pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC组，pcDNA3.1-DLEU2+miR-30d-5p组Tca8113细胞凋亡率显著降低，Bax表达水平显著降低(P<0.05)，而Bcl-2表达水平显著升高(均P<0.05)，见表5、图6。表明过表达miR-30d-5p可逆转DLEU2对TSCC细胞Tca8113凋亡的促进作用。

图6 过表达miR-30d-5p能逆转DLEU2对TSCC细胞Tca8113凋亡蛋白表达的影响

表5 过表达miR-30d-5p能逆转DLEU2对TSCC细胞Tca8113凋亡的影响

3 讨 论

晚期TSCC患者生存率极低，由于舌组织富含大量血管及淋巴管导致患者常伴有局部扩散及转移，严重降低患者生活质量〔8〕。研究表明miRNA与TSCC发生及发展密切相关，但仍有部分miRNA对TSCC细胞恶性生物学行为的影响尚未可知〔9〕。LncRNA可作为miRNA的海绵分子竞争性吸附其与靶基因的结合位点进而间接调控靶基因表达从而调控肿瘤细胞增殖、分化等生物学进程〔10〕。

DLEU2在胰腺癌细胞中呈高表达，沉默DLEU2表达后可通过上调miR-455表达进而抑制胰腺癌细胞增殖及迁移〔11〕。DLEU2属于miR-15a/16-1簇的宿主基因，其可通过调控miR-15a/16-1表达而调控转录核因子(NF)-κB信号通路进而抑制肿瘤发生及发展〔12〕。这可能由于肿瘤细胞恶性程度及组织部位不同导致DLEU2的表达及其作用效果不同。研究报道指出DLEU2缺失可导致慢性淋巴细胞性白血病及其他肿瘤发生〔13～15〕。本研究结果说明DLEU2在TSCC发生过程中可能发挥抑癌基因作用。研究报道指出细胞增殖周期中CyclinD1是调控细胞增殖信号的主要蛋白，其可激活CDK4/CDK6进而正向调控细胞周期，p21是CDK抑制因子并可抑制CDK4/CDK6激活进而抑制细胞增殖〔16〕。细胞凋亡过程中涉及多种基因调控，其中Bax、Bcl-2是调控细胞凋亡的主要基因，Bcl-2是抗凋亡基因，Bax是促凋亡基因，Bax表达水平升高可抑制Bcl-2的作用进而抑制细胞凋亡〔17〕。本研究结果提示DLEU2可能作为TSCC靶向治疗的潜在靶点。miR-30d-5p在宫颈癌患者外泌体中呈高表达，并可作为临床诊断宫颈癌的重要辅助标志物〔18〕。miR-30d-5p在非小细胞肺癌组织及细胞中均呈低表达，其可通过靶向抑制CCNE2基因表达进而减弱非小细胞肺癌细胞增殖活力〔19〕。分析原因可能为不同肿瘤组织或细胞中miR-30d-5p的表达不同。研究表明前列腺癌组织及细胞中miR-30d-5p的表达水平均显著降低，上调miR-30d-5p表达可通过靶向调控NT5E表达进而抑制前列腺癌细胞增殖和迁移〔20〕。本研究结果提示DLEU2可通过抑制miR-30d-5p表达而促进TSCC细胞凋亡并抑制其增殖进而参与TSCC发生及发展过程。