丹参多酚酸盐对H2O2所致心肌细胞氧化应激损伤及PPARγ/Nrf2/HO-1通路的影响

李 兵

随着人们生活水平的提高、膳食结构的改变及人口老龄化的加剧，我国心血管疾病致死率居致死疾病首位，也是我国居民猝死的主要诱因之一[1]。活性氧(reactive oxygen species，ROS)过剩所致氧化应激损伤及ROS诱导细胞凋亡与各种心血管疾病进展密切相关[2]，其中冠状动脉粥样硬化性心脏病、心肌梗死及治疗实现再灌注后引起ROS大量产生过剩[3]。因此，寻找能降低氧化应激损伤、抑制心肌细胞凋亡的新型药物成为目前治疗研究的热点。

丹参多酚酸盐(salvianolate，SAL)是中药丹参的水溶提取物，具有良好的抗氧化活性[4]，临床主要用于轻度、中度稳定型心绞痛的治疗。过氧化物酶体增殖子活化受体(PPARγ)/核转录因子E2相关因子2(Nrf2)/抗血红素加氧酶-1(HO-1)通路在氧化应激反应中发挥着重要的调控作用[5-6]。本研究以H9c2心肌细胞为研究对象，探讨SAL对H2O2所致心肌细胞氧化应激损伤的影响及PPARγ/Nrf2/HO-1通路在其中发挥的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 H9c2心肌细胞购自上海中国科学院细胞库。将H9c2细胞接种于含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，每3 d传代1次，取第3代对数生长期H9c2细胞进行实验研究。

1.2 实验药物与试剂 SAL购自上海绿谷制药有限公司[规格：每瓶50 mg(含丹参乙酸镁40 mg)，批号1903027]；DMEM培养基购自美国Hyclone公司；胰酶、胎牛血清购自美国Invitrogen公司；青链霉素、DMSO、四唑盐(MTT)试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司；2，7-双乙酸二氯荧光(DCFH-DA)探针购自美国Sigma公司；兔抗鼠PPARγ、Nrf2、HO-1、核转录因子-κB(NF-κB)、激活型半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)抗体购自购自Abcam公司；山羊抗兔IgG二抗、ROS试剂盒、电化学发光(ECL)试剂盒、Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒、放射免疫沉淀(RIPA)蛋白裂解液、2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠(BCA)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司。

1.3 实验仪器 HERACell 150i型细胞培养箱(德国Thermo公司)；Synergy Mx型多功能荧光酶标仪(美国Bio-Tek公司)；ST16R型超速冷冻离心机(美国Beckman公司)；FACS Calibur流式细胞仪、PowerPac HV型电泳仪、Trans-Blot SD型转膜仪(美国Bio-Rad公司)；C600型凝胶成像系统(美国Azure公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 心肌细胞氧化应激损伤模型制备与分组 细胞模型制备[7]：取对数生长期H9c2心肌细胞，经胰酶消化和重悬后制备浓度为5×105个/mL的单细胞悬液，每孔200 μL接种于6孔细胞培养板中培养24 h后，更换含有100 μmol/L H2O2的培养基继续培养4 h以制备H2O2诱导H9c2心肌细胞氧化损伤模型，设置H2O2组、SAL 50 mg/L组、SAL 100 mg/L组、SAL 200 mg/L组；另取对数生长期H9c2心肌细胞作为正常组。

1.4.2 细胞增殖率检测 各组细胞经胰酶消化和重悬后制备浓度1×105个/mL的单细胞悬液，每孔100 μL接种于96孔细胞培养板，每组设10个复孔；SAL 50 mg/L组、SAL 100 mg/L组、SAL 200 mg/L组分别加入含50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L的SAL培养液，H2O2组和正常组加入常规培养液，继续培养24 h后，每孔10 μL加入细胞计数试剂盒8(CCK-8)溶液，继续培养2 h后消化并收集细胞，之后通过酶标仪测定570 nm处吸光度(A)，细胞增殖抑制率(%)=(A药物组/A正常组)×100%。

1.4.3 细胞凋亡检测 各组细胞经胰酶消化和重悬后制备浓度为5×105个/mL的单细胞悬液，以每孔200 μL接种于6孔细胞培养板，每组设10个复孔；SAL 50 mg/L组、SAL 100 mg/L组、SAL 200 mg/L组分别加入含50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L的SAL培养液，H2O2组和正常组加入常规培养液，继续培养24h后消化，2 000 r/min离心5 min收集细胞，按照试剂盒说明，滴加稀释后的结合缓冲液重悬细胞，滴加Annexin V-FITC和PI染液，37 ℃避光孵育15 min后，采用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.4.4 细胞ROS含量检测 取浓度1×105个/mL的单细胞悬液，每孔100 μL接种于黑底不透明的96孔细胞培养板，每组设10个复孔；SAL 50 mg/L组、SAL 100 mg/L组、SAL 200 mg/L组分别加入含终浓度50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L的SAL培养液和终浓度10 μmol/L的DCFH-DA培养液，H2O2组和正常组加入含终浓度10 μmol/L的DCFH-DA常规培养液，继续培养30 min后，磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤2次去除未进入细胞内的DCFH-DA，之后通过荧光显微镜观察细胞内ROS(激发波长488 nm，发射波长525 nm)；通过荧光酶标仪检测荧光强度，荧光强度反映ROS含量。

1.4.5 CK-MB、LDH漏出量和MDA含量及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性检测 参照1.4.3中方法分组和给药干预后，取各组细胞上清液，按照试剂盒操作说明，通过生化分析仪检测各组细胞CK-MB、LDH漏出量。弃培养液，胰酶消化并以2 000 r/min离心5 min收集细胞，滴加RIPA蛋白裂解液于冰上裂解30 min后，4 ℃、3 500 r/min离心10 min取上清液，采用硫代巴比妥酸法检测MDA含量，黄嘌呤氧化法、钼酸铵法分别检测SOD、CAT活性。

1.4.6 细胞蛋白表达检测 参照1.4.3中方法分组和给药干预后，消化并收集细胞，滴加RIPA蛋白裂解液于冰上裂解30 min后，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度后沸水浴5 min，使蛋白完全变性，以30 μg蛋白量上样进行5%浓缩胶(60 V电压)和10%分离胶(100 V电压)电泳分离，半干法转聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，置PVDF膜于5%脱脂奶粉室温封闭1h，分别滴加稀释后的目标蛋白、β-actin一抗4 ℃孵育过夜，PBS洗膜3次后滴加山羊抗兔二抗37 ℃孵育1 h，PBS洗膜3次后滴加ECL溶液，暗盒中显影后采用凝胶成像系统分析条带灰度值，以β-actin为内参半定量分析目的蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1 SAL对H2O2损伤H9c2心肌细胞增殖率和凋亡率的影响 与正常组比较，H2O2组H9c2心肌细胞增殖率降低，凋亡率升高(P<0.01)；与H2O2组比较，SAL 50 mg/L组、SAL 100 mg/L组、SAL 200 mg/L组H9c2心肌细胞增殖率升高，凋亡率降低(P<0.05或P<0.01)。详见图1、图2。

图1 SAL对H2O2损伤H9c2心肌细胞凋亡的流式细胞图(A为正常组；B为H2O2组；C为SAL 50 mg/L组；D为SAL 100 mg/L组；E为SAL 200 mg/L组)

与正常组比较，＊P<0.01；与H2O2组比较，△P<0.05，△△P<0.01。图2 各组H9c2心肌细胞增殖率和凋亡率比较(A为细胞增殖率；B为细胞凋亡率)

2.2 各组H9c2心肌细胞ROS含量比较 与正常组比较，H2O2组H9c2心肌细胞ROS含量升高(P<0.01)；与H2O2组比较，SAL 100 mg/L组、SAL 200 mg/L组H9c2心肌细胞ROS含量降低(P<0.05或P<0.01)。详见图3、图4。

图3 SAL对H2O2损伤H9c2心肌细胞ROC含量的荧光强度

与正常组比较，＊P<0.01；与H2O2组比较，△P<0.01。 图4 各组H9c2心肌细胞ROS含量比较

2.3 各组H9c2心肌细胞CK-MB、LDH漏出量比较 与正常组比较，H2O2组H9c2心肌细胞CK-MB、LDH漏出量升高(P<0.01)；与H2O2组比较，SAL 100 mg/L组、SAL 200 mg/L组H9c2心肌细胞CK-MB、LDH漏出量降低(P<0.05或P<0.01)。详见图5。

与正常组比较，＊P<0.01；与H2O2组比较，△P<0.05，△△P<0.01。图5 各组H9c2心肌细胞CK-MB、LDH漏出量比较(A为CK-MB；B为LDH)

2.4 各组H9c2心肌细胞MDA含量和SOD、CAT活性比较 与正常组比较，H2O2组H9c2心肌细胞MDA含量升高，SOD、CAT活性降低(P<0.01)；与H2O2组比较，SAL 100 mg/L组、SAL 200 mg/L组H9c2心肌细胞MDA含量降低，SOD、CAT活性升高(P<0.05或P<0.01)。详见图6。

与正常组比较，＊P<0.01；与H2O2组比较，△P<0.05，△△P<0.01。图6 各组H9c2心肌细胞MDA含量和SOD、CAT活性比较(A为MDA含量；B为SOD活性；C为CAT活性)

2.5 各组H9c2心肌细胞PPARγ、Nrf2、HO-1、NF-κB、Cleaved Caspase-3蛋白表达比较 与正常组比较，H2O2组H9c2心肌细胞PPARγ、Nrf2、HO-1蛋白表达下调，NF-κB、Cleaved Caspase-3表达上调(P均<0.01)；与H2O2组比较，SAL 50 mg/L组、SAL 100 mg/L组、SAL 200 mg/L组H9c2心肌细胞PPARγ、Nrf2、HO-1蛋白表达上调，NF-κB、Cleaved Caspase-3表达下调，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见图7、图8。

图7 各组H9c2心肌细胞PPARγ、Nrf2、HO-1、NF-κB、Cleaved Caspase-3蛋白表达电泳图(A为正常组；B为H2O2组；C为SAL 50 mg/L组；D为SAL 100 mg/L组；E为SAL 200 mg/L组)

与正常组比较，＊P<0.01；与H2O2组比较，△P<0.05，△△P<0.01。图8 各组H9c2心肌细胞PPARγ、Nrf2、HO-1、NF-κB、Cleaved Caspase-3蛋白相对表达量比较

3 讨 论

H2O2是细胞生理代谢过程中重要的中间产物，参与基因转录与表达、细胞增殖等过程，但过量的H2O2将诱发细胞内ROS大量生成，过度消耗以ROS为底物的抗氧化酶(SOD、CAT)，引起ROS过剩蓄积导致氧化应激反应，破坏蛋白、核酸、DNA等大分子诱导细胞凋亡[8]；ROS可攻击生物膜中不饱和脂肪酸导致的过氧化损伤，具有生物毒性的MDA是过氧化终产物之一，且细胞膜损伤后细胞内CK-MB、LDH将漏出，因此，ROS、CK-MB、LDH、MDA含量及SOD、CAT活性可反映细胞氧化应激损伤程度[9]。

SAL是丹参的水溶提取物，具有良好的抗氧化活性[4]。本研究通过H2O2干预制备H9c2心肌细胞氧化应激损伤模型，给予不同浓度的SAL进行干预，结果显示，经SAL干预能显著提高H9c2心肌细胞增殖率，降低细胞凋亡率、细胞ROS、MDA含量和CK-MB、LDH漏出量，提高SOD、CAT活性，提示SAL对H2O2所致H9c2心肌细胞氧化应激损伤具有保护作用。Nrf2是体内细胞普遍存在的一种核转录因子，对细胞氧化应激反应具有重要的调控作用[10]。Deshmukh等[11]研究显示，ROS能诱导Nrf2与抑制剂Keap1解离而活化，移核转位并激活抗氧化反应元件，促进抗氧化酶(SOD、CAT等)转录与表达。HO-1是Nrf2下游基因，氧化应激状态下Nrf2被激活进入核后将启动HO-1转录表达而催化降解血红素、一氧化碳等，抑制氧化应激损伤[12]。NF-κB能促进巨噬细胞活化和浸润，诱导促凋亡蛋白Caspase-3表达与活化，促进细胞凋亡[13]；Huang等[14]研究显示，HO-1能抑制NF-κB启动子核转录因子κB激酶抑制剂(IKK)β磷酸化从而抑制NF-κB活化。PPARγ对葡萄糖、脂质代谢等具有重要的调节作用，Hang等[15]研究显示，PPARγ与Nrf2启动子结合促进Nrf2表达。本研究结果显示，经SAL干预能上调PPARγ、Nrf2、HO-1表达并下调NF-κB、Cleaved Caspase-3表达。

综上所述，SAL对H2O2所致H9c2心肌细胞氧化应激损伤具有保护作用，其作用机制可能与激活PPARγ/Nrf2/HO-1通路有关。