内质网应激相关凋亡与心肌缺血损伤的研究进展

刘 悦，唐晓丽，牛芬溪，方 芳

心肌缺血是一种常见的心血管疾病，目前我国患病率呈逐年上升趋势，疏通血管实现再灌注是治疗心肌缺血的常见方式，但血液复流可能引起心肌二次损伤。寻找安全有效的治疗方式是心肌缺血面临的重要任务，关于心肌缺血损伤的病理机制研究发现，内质网应激通过多条途径在心肌缺血损伤中发挥着重要作用[1]。内质网应激是内质网处于非正常状态产生的一种应激反应，通过引起未折叠蛋白反应对机体产生保护或损伤。相关研究发现，调控内质网应激相关凋亡反应可能成为减轻心肌缺血损伤的一种新型治疗策略[2-3]。现综述内质网应激的定义、引起心肌细胞凋亡的方式、调控参与内质网应激相关的凋亡分子缓解心肌缺血损伤，以期为防治心肌缺血损伤提供治疗策略。

1 内质网应激

内质网应激主要表现有3种不同的反应即未折叠蛋白质反应、内质网过度负荷反应和固醇调节级联反应，其中未折叠蛋白反应是介导内质网应激的重要信号机制[4]。未折叠蛋白反应通过减少内质网外蛋白翻译，增加内质网内蛋白折叠效率，加强内质网相关蛋白降解(ER-associated degradation，ERAD)或自噬等生物过程以减少内质网内蛋白质积聚，促使蛋白质平衡恢复，进而保证细胞存活[5]。若内质网应激过重或持续时间较长，细胞功能性障碍和凋亡信号通路将被启动[6]。

未折叠蛋白反应主要由3条相互交织的通路组成，每条通路均由内质网膜跨膜蛋白启动，内质网内腔未折叠蛋白传感器的3种跨膜蛋白分别为蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)、Ⅰ型内质网跨膜蛋白激酶(type-1 ER transmembrane protein kinase，IRE1)和活化转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)。葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78/immunoglobulin binding protein，GRP78/BiP)是未折叠蛋白反应的另一种关键蛋白，正常生理状态下，GRP78分别与PERK、IRE1、ATF6结合处于稳定状态[7]。内质网应激时，GRP78被招募参与折叠新的蛋白质，而与3种跨膜蛋白发生分离，此时3条信号通路被激活进而引起一系列级联反应，如促进内质网应激相关基因转录和翻译，提高蛋白质正确折叠能力，抑制蛋白质产生和积聚等保护作用；诱导C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(9CCAAT/enhancer binding protein homologous protein，CHOP)等凋亡蛋白表达进而引起凋亡等损伤作用[8]。

2 内质网应激引起心肌细胞凋亡的方式

有研究显示，未折叠蛋白反应分为早期、中期和晚期，早期主要是启动上述3条通路，代偿性减少未折叠蛋白数量，中期主要通过激活核转录因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)和c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)引起细胞炎症反应，若这两个阶段的未折叠蛋白反应未缓解未折叠蛋白负荷，晚期未折叠蛋白反应将启动凋亡程序导致细胞损伤[9]。心肌缺血或缺血再灌注损伤分子机制复杂，涉及细胞内钙离子超载、细胞凋亡、线粒体损伤、氧化应激、炎症、自噬等，内质网应激与这些病理过程相互影响。Fang等[10]研究显示，内质网应激参与心肌缺血损伤，如二硫苏糖醇(未折叠蛋白反应激动剂)增强心肌缺血再灌注造成细胞凋亡，增加心肌梗死面积。Zhang等[11]对心肌缺血损伤与内质网应激的关系研究中发现，细胞凋亡是引起心肌损伤的主要途径，具体有以下3种方式：CHOP途径、c-Jun氨基末端激酶途径(JNK途径)、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-12途径[11]。详见图1。

图1 内质网应激下细胞凋亡途径

2.1 CHOP途径诱导的心肌细胞凋亡 CHOP也称GADD153，是内质网应激诱导凋亡产生的标志性分子。IRE1和ATF6均可直接诱导CHOP引发细胞凋亡，而PERK经过转录因子4(activating transcription factor 4，ATF4)途径间接调节CHOP引起细胞凋亡。Liu等[12]研究发现，创伤后应激大鼠伴随心肌缺血损伤发生，主要是由于内质网应激介导PERK/CHOP途径诱导心肌细胞凋亡引起。ATF4具有细胞凋亡的作用，但在缺血心肌细胞诱发内质网应激后，ATF4只有在PERK激活后通过提高CHOP表达，进而发挥促进心肌细胞凋亡的作用[13]。另有研究发现，PERK通过激活翻译起始因子(elF2α)引起凋亡蛋白CHOP表达，进而诱导细胞凋亡[14]。CHOP通过下调多种途径引起心肌细胞凋亡，其表达增多破坏内质网膜完整性，引起内质网内Ca2+外流，通过钙调蛋白分解酶激活Caspase-12引起Caspase介导的细胞凋亡。有研究显示，缺氧/复氧的H9c2心肌细胞存在内质网应激的发生，其中Caspase家族蛋白表达含量显著提高[15]。CHOP可直接激活GADD34，并使之作用于蛋白激酶1，促进p-eIF2α发生去磷酸化，引起蛋白合成量增加，导致细胞因内质网蛋白超负荷而凋亡[16]。CHOP过量表达抑制抗凋亡基因B淋巴细胞瘤2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)转录，破坏抗凋亡蛋白Bcl-2和凋亡蛋白Bcl2-Associated X(Bax)的平衡，使Bax表达量相对增加，促进细胞凋亡[17]。Wang等[18]研究表明，心肌缺血再灌注组有利于凋亡的CHOP、Bax表达含量增加，抑制凋亡Bcl-2表达含量减少。

2.2 JNK途径诱导的心肌细胞凋亡 心肌细胞缺血缺氧诱导内质网应激发生时，跨膜蛋白IRE1与GRP78解离，内质网膜上的肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2，TRAF2)向胞浆中IRE1激酶结构域聚集，两者相互作用共同诱导细胞凋亡信号激酶1(apoptosis singnal-regulating kinase 1，ASK1)，三者合成IRE1-TRAF2-ASK1复合物[19]，进一步激活JNK。JNK又称为应激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase，SAPK)，通过下列方式发挥作用：①JNK被激活后转移至细胞核内，导致内质网膜完整性被破坏，Ca2+外流增加，分解酶活化Caspase-12，引起Caspase家族诱导的细胞凋亡；②JNK被激活后，线粒体膜通透性加强，促进细胞色素C表达，引起线粒体途径细胞凋亡；③大量活化的JNK促进细胞凋亡因子表达，如CHOP、Caspase-3及Bcl-2家族中促凋亡因子P53、Bax、Bak等，抗凋亡因子Bcl-2、Bcl-xl表达减少，促使细胞凋亡[20-21]；④被激活后的JNK转移到细胞核内，可调节转录因子，进而诱导肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor，TNF)、凋亡蛋白Fas-L等配体表达，激活死亡受体途径促进细胞凋亡。

2.3 Caspase-12蛋白酶途径引起的心肌细胞凋亡 Caspase-12是内质网膜上特异性结合的水解蛋白，也是参与内质网应激引起凋亡的标志分子。Caspase-12是Caspase家族中唯一一个参与内质网应激而不参与线粒体途径和死亡受体途径的分子，在心肌细胞凋亡中发挥着重要作用[22]。丁玉红等[23]研究丹参素对缺氧/复氧H9c2细胞的改善作用发现，丹参素可降低缺血心肌细胞Caspase-12表达，缓解内质网应激引起的细胞凋亡。田倪妮等[24]对67例急性心肌梗死病人进行临床分析，结果显示Caspase-12可启动细胞凋亡程序，并阐明内质网应激主要通过以下途径激活Caspase-12：①TRAF2途径即内质网应激引起Procaspase-12与TRAF2形成复合物发生解离被激活；②钙蛋白酶Calpain途径即内质网应激发生后，Ca2+稳态被破坏，钙蛋白酶被激活后转移到内质网外膜，对Procaspase-12进行切割形成活化的Caspase-12，进入胞浆发挥作用；③Caspase-7途径即内质网应激引起Caspase-7和促凋亡蛋白Bim移位至内质网外膜，对Procaspase-12进行切割使其活化。

3 调控内质网应激相关凋亡蛋白缓解心肌缺血损伤

随着内质网应激与心肌缺血关系的不断研究，一些化合物已证实通过缓解内质网应激发挥改善心肌缺血损伤的作用。Tang等[25]通过对缺氧/复氧心肌细胞研究发现，柚皮素(Naringenin)可逆转内质网应激引起的CHOP和Caspase-12增加，同时逆转磷酸化的ATF6、PERK、IRE1，缓解缺氧复氧造成的心肌细胞损伤。Zhao等[26]建立大鼠心肌缺血再灌注损伤体内模型和缺氧复氧细胞模型，使用Janus激酶2/信号传导与转录激活因子3(JAK2/STAT3)通路抑制剂，发现小檗碱(berberine)可激活内质网应激中JAK2/STAT3信号通路达到改善缺血心肌细胞损伤的目的，同时抑制PERK和eIF2α磷酸化，进而抑制ATF4和CHOP凋亡蛋白表达。Yu等[27]研究发现紫丹酸(tournefolic acid B)预处理能改善离体大鼠心脏血流动力学参数和心功能，通过促进磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(AKT)的磷酸化，降低CHOP和Caspase-12表达，增加Bcl-2/Bax比例，抑制心肌细胞凋亡损伤。人牛吡啶(Apelin-13)通过PI3K/AKT、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和细胞外信号调节激酶(ERK)等激活抑制内质网应激引起的凋亡通路，减少CHOP、Caspase-12、JNK表达，降低心肌缺血再灌注损伤[28]。Zhang等[29]研究显示，五味子乙素(schisandrin B)通过抑制心肌缺血再灌注大鼠CHOP和Caspase-12蛋白表达，减少细胞凋亡，保护缺血心肌。

4 小 结

细胞凋亡是引起心肌缺血损伤的重要因素，内质网应激调控的细胞凋亡与心肌缺血损伤过程密切相关。虽然细胞凋亡发生、发展的具体分子机制尚不明确，通过干扰内质网应激相关凋亡反应参与心肌缺血损伤的作用环节和作用靶点有望成为疾病的新型治疗方式，值得进一步深入研究。