白介素-18、E-钙黏蛋白和白介素-18结合蛋白c在食管癌中的表达情况及与患者TNM分期、淋巴结转移和生存期的相关性

常 丽，卞勇华，邱 静，黄思怡，史卫红

食管癌是常见的恶性肿瘤之一，居世界癌症死因第6位, 中国癌症死因第4位，且总体5年生存率仅为20%～30%，中晚期患者失去手术机会，常规放化疗的5年生存率不到10%，严重威胁患者生命安全[1-2]。目前手术治疗是主要治疗方案，但术后易侵袭转移、复发，数据显示术后1年内复发率高达22.5%[3]，因此需探寻食管癌发生、转移等生物学行为的相关细胞因子具有重要临床价值。白介素-18（IL-18）在调控肿瘤微环境的免疫功能以及抗血管生成过程中发挥重要作用，如可调节Th1 /Th2细胞的分化，活化CD4+和CD8+T细胞，以及促进Fas-FasL诱导的细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用[4]。白介素-18结合蛋白( interleukin-18 binding protein, IL-18BP)是IL-18内源性抑制物，可拮抗IL-18功能，从而促进肿瘤细胞的生长、增殖以及迁移等生物学行为，其中IL-18BPc是其的一种具有生物学活性的亚型[5]。E-钙黏蛋白(E-cadherin)属于细胞黏附性分子，其的下调、缺失或者功能障碍均可导致肿瘤细胞的侵袭转移，增加了术后复发的风险[6]。IL-18、E-cadherin和IL-18BPc均参与肿瘤的发生、发展，但与食管癌的进展、转移以及生存期的相关性尚未见报道，因此本次研究结合临床病理资料分析检测IL-18、E-cadherin、IL-18BP的表达与食管癌的进展和转移的相关性，为寻找预后判断及治疗相关的分子靶标开辟新途径。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取食管癌的64例患者，获取食管癌组织标本（研究组）以及正常癌旁组织标本（对照组）。入组患者男、女分别为48例、16例，年龄40～72岁。根据国际抗癌联盟于2009年修订食管癌TNM分期标准[7]，Ⅰ期8例、Ⅱ期28例、Ⅲ期24例，IV期4例。淋巴结转移35例，无淋巴结转移29例。本研究已通过本院伦理委员会审核。纳入标准：1）对照组患者经病理组织活检确诊为食管鳞状细胞癌；2）尚未开始放化疗的食管鳞患者，均签署知情同意书。排除标准：1）已接收放化疗治疗；2）病例资料不完整者。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组化法检测IL-18、E-cadherin和IL-18BPc表达水平 应用免疫组化法检测患者标本中IL-18、E-cadherin和IL-18BPc表达水平。术中切除食管癌组织以及正常癌旁组织，采用甲醛溶液（40 g/L）固定，并进行石蜡包埋，连续切片（厚度4 μm），采用免疫组织化学染色以及苏木精-伊红染色。脱水脱蜡处理后抗原修复液（0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液）修复15 min，随后磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L）冲洗切片，加入非免疫血清孵育约10 min。切片滴加一抗鼠抗人IL-18、E-cadherin或IL-18BPc单克隆抗体并4℃过夜，PBS缓冲液冲洗3～4次，加入新鲜配制的二氨基联苯胺溶液，之后蒸馏水漂洗、苏木精复染，脱水、封片后于显微镜下观察IL-18、E-cadherin、IL-18BPc表达情况。

胞质中呈棕黄色或棕褐色颗粒表明IL-18BPc或IL-18呈阳性，细胞膜呈棕黄褐色表明 E-cadherin表达阳性。显微镜下半定量积分法判断阳性结果，于200倍视野下随机选取3个视野，对每张切片的染色强度、阳性细胞占比计分，染色强度分为0分（无色）、1分（浅黄色）、2分（棕黄色）以及3分（黄褐色），阳性细胞占比分为0分（≤5%）、1分（6% ～25%）、2分（26% ～50%）以及3分（>50%）四个分值[8]。上述染色强度、阳性细胞占比得分相乘，所得结果为 0、1～3、4～6、7～9分，分别代表阴性（-）、弱阳性（+）、中等阳性（++）、强阳性（+++），得分<1分，则表明为阴性，否则为阳性。由两位病理医师单独完成染色评估，取其共同结论为最终结果，若结果存在争议，以二者讨论后确定的结论为准。

1.2.2 收集临床资料 临床资料主要包括包括性别、年龄、淋巴结转移情况、TNM分期以及5年生存情况。比较不同临床资料患者的IL-18、E-cadherin和IL-18BPc表达水平有无差异，并进行Spearman相关分析以及影响因素分析。

1.3 统计学方法 使用SPSS 20.0处理数据，计量资料采用例数(%)表示，组间比较采用卡方检验，等级资料采用秩和检验，采用Spearman秩相关进行相关性检验，用Kaplan-Meier法描述肿瘤组织中不同IL-18、E-cadherin和IL-18BPc水平的生存率，影响因素分析采用Logistic回归分析，生存率之间的比较采用log-rank检验。P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 IL-18、E-cadherin和IL-18BPc的 表 达 情况 研究组IL-18、E-cadherin表达阳性率低于对照组，IL-18BPc表达阳性率高于对照组，研究组的E-cadherin强阳性（+++）率低于对照组，IL-18BPc强阳性（+++）率高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1～表3。

表1 IL-18在两组中的表达

表2 E-cadherin在两组中的表达

表3 IL-18BPc在两组中的表达

2.2 不同临床资料患者中IL-18、E-cadherin和IL-18BPc的表达 IL-18、E-cadherin和IL-18BPc阳性率在不同年龄、性别患者中的表达无显著差异（P>0.05），在淋巴结转移、TNM分期、不同生存时间患者中的阳性率有统计学差异（P<0.05），见表4。

表4 不同临床资料患者中，IL-18、E-cadherin和IL-18BPc的表达

2.3 相关性分析 64例患者随访5年，死亡49例，中位生存时间33个月，采用Spearman相关分析结果显示，IL-18、E-cadherin和IL-18BPc分别与生存时间均具有相关性，r分别为0.638、0.578、-0.529，P值均低于0.05。

2.4 食管癌组织IL-18、E-cadherin和IL-18BPc水平与影响生存时间的危险因素分析 以患者是否死亡为因变量（是=1，否=0），以IL-18、E-cadherin和IL-18BPc表达水平（阳性=1，阴性=0）、淋巴结转移（是=1，否=0）、TNM分期（Ⅰ、Ⅱ期=1，Ⅲ、Ⅳ期=0）为自变量，进行Logistic回归分析，研究显示IL-18、E-cadherin和IL-18BPc、淋巴结转移以及TNM分期均是影响患者生存情况的危险因素（P<0.05），见表5。IL-18、E-cadherin 高表达者的5 年生存率（36.67%、35.29%）高于低表达者（11.76%、10.00%），而IL-18BPc高表达者的5 年生存率（16.67%）低于低表达者（43.75%），见图1～图3。

表5 患者生存情况影响因素Logistic回归分析

图1 IL18表达与食管癌患者生存时间的关系

图2 E-cadherin表达与食管癌患者生存时间的关系

图3 IL-18BPc表达与食管癌患者生存时间的关系

3 讨论

食管癌包括食管鳞状细胞癌、食管腺癌两种病理类型，其中我国以鳞癌为主（占90%以上），晚期食管癌治疗仍是世界性的难题[9]，寻找食管癌诊断的分子标志和治疗靶点对于食管癌的治疗具有指导意义。IL-18主要由活化的巨噬细胞产生，可促进Fas介导的NK细胞的T细胞毒性，诱导Th1细胞释放大量的IFN-γ、GM-CSF，从而发挥免疫调节作用，抑制多种恶性肿瘤的生长，如黑色素瘤细胞、肺癌细胞、淋巴瘤细胞等[10-11]。IL-18BP是IL-18天然的拮抗物，一方面通过抑制IL-18相关的生物学活性而促进肿瘤细胞的生长，还可通过促进骨髓来源内皮祖细胞的动员和分化以及活化VEGF/Akt信号途径而刺激新生血管生成，其中IL-18BPc是有生物学活性的IL-18BP的一种亚型，可通过上调VEGF的表达促进肿瘤血管形成，诱导肿瘤侵袭、转移[12]。本次研究结果发现研究组IL-18、E-cadherin表达阳性率低于对照组，IL-18BPc表达阳性率高于对照组（P<0.05），与刘检等报道一致[13-14]。同时，研究发现IL-18、E-cadherin、IL-18BPc在食管癌组织中的表达水平与淋巴结转移、TNM分期、生存时间密切关联(P<0.05)，提示IL-18、IL-18BPc对于评估食管癌的进展及预后均具有重要意义。IL-18在机体免疫网络中发挥重要的调节作用，增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，同时还能参与肿瘤细胞逃避免疫识别机制，以及增加sICAM-1、E-cadherin的表达，从而促进血管壁的粘附和抑制肿瘤细胞的转移[15]。IL-18、IL-18BPc形成一个负反馈调节机制，调节Th1反应，共同调控免疫功能，两者表达水平的失衡导致免疫调节功能减弱，导致肿瘤扩散至相邻组织、区域淋巴结受累等，最终增加治疗难度，故而Spearman相关分析结果显示IL-18、IL-18BPc分别与生存时间均具有相关性。

E-cadherin是介导细胞间连接的一种关键糖蛋白，作为胃癌、乳腺癌、食管癌等多种恶性肿瘤的预测标志物之一，其表达水平也会影响肿瘤的发生发展及预后[16]。E-cadherin是重要的下调上皮标志物，通过稳定细胞间的连接而抑制侵袭和转移[17]，本次研究发现食管癌组织中E-cadherin低水平表达，表明转移能力增加，故而E-cadherin阳性患者淋巴结转移率明显高于E-cadherin阴性患者。郝雁冰等[18]研究发现E-cadherin表达与淋巴结转移、肿瘤肌层浸润深度呈一定程度的负相关性，淋巴结转移、肌层浸润程度越深的患者食管癌组织中E-cadherin表达明显下调，与本次研究结果一致，即E-cadherin表达降低或者功能缺失，肿瘤细胞的活动能力范围增加，脱离原发灶，故而远处转移和浸润能力增加。同时，Rao等发现E-cadherin减少还可导致E-cadherin复合物的降解，诱导β-链蛋白入细胞核并在细胞质内聚集，进而激活WNT信号通路，导致肿瘤的发生发展[19-20]。肿瘤组织中E-cadherin、IL-18低表达，而IL-18BPc高表达，肿瘤处于高分期状态，且淋巴结转移率明显增加，进一步证实三者表达水平与管癌的进展和转移密切关联，故而此次研究发现IL-18、E-cadherin高表达者的5年生存率（36.67%、35.29%）高于低表达者（11.76%、10.00%），而IL-18BPc高表达者的5年生存率（16.67%）低于低表达者（43.75%）。因此，可通过检测肿瘤组织中IL-18、IL-18BPc、E-cadherin表达水平评估预后情况，并针对性开展采取治疗措施，降低死亡率。

综上所述，IL-18、E-cadherin和IL-18BPc均在食管癌组织中异常表达，表达水平与患者病情严重程度及预后情况具有相关性，具有较好的临床应用价值。