异丙酚通过调控miR-506对骨肉瘤细胞增殖、迁移侵袭及凋亡的影响

刘元豪，郑一鸣，王 斌，韦 敏

骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤，主要发生在儿童和青少年中，并显示出向肺转移的趋势[1]。外科肿瘤切除、全身化疗和靶向放疗是目前用于治疗骨肉瘤的标准治疗策略，但患者5年生存率仍然很低[2]。因此，需要开发治疗骨肉瘤更高效率的新型药物。异丙酚（2,6-二异丙基苯酚）目前是临床上最常用的麻醉剂之一[3]。但最近研究发现，异丙酚不仅在手术中用作镇静药或催眠药，而且还显示出许多非麻醉作用，例如抗肿瘤活性[4]。异丙酚可以通过上调胃癌的SGC-7901和MKN45细胞中的miR-140-5p来显著抑制细胞增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡[5]。异丙酚通过下调转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)的表达，抑制骨肉瘤细胞的侵袭，诱导细胞凋亡[6]。微小RNA（MicroRNA，miRNA/miR）是一类小的非编码RNA（19～24个核苷酸），通过抑制翻译或促进mRNA降解来介导目标基因的转录后调控[7]。资料显示，miR-506在骨肉瘤中的水平降低，miR-506过表达减少骨肉瘤细胞的侵袭，miR-506的抑制导致细胞侵袭增加[8]。长链非编码RNA RHPN1-AS1充当miR-506的竞争性内源RNA，在骨肉瘤中发挥促癌作用[9]。近年来，已经证明一些麻醉剂能够控制肿瘤生长的miRNA，包括异丙酚，其通过调节miRNA的表达来调节癌症的发展[10]。例如异丙酚通过上调骨肉瘤中的miR-143表达产生抗肿瘤潜力[11]。因此，本研究旨在验证异丙酚通过调节人骨肉瘤细胞中的miR-506表达来抑制增殖、迁移侵袭并诱导凋亡。

1 材料与方法

1.1 材料 骨肉瘤细胞株HOS（美国典藏培养物保存中心），RPMI 1640培养基、Opti-MEM（美国Gibco公司），异丙酚（美国Sigma-Aldrich公司 ），miR-506 mimic、miR-506 inhibitor、 对 照miR-NC、anti-miR-NC（上海GenePharma公司），放射免疫沉淀分析（Radio Immunoprecipitation Assay，RIPA）裂解缓冲液（上海申能博彩生物公司），细胞周期蛋白（Cyclin）D1、p21、基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、B细胞淋巴瘤/白 血 病 -2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）、Bcl-2相 关 X蛋 白（Bcl-2 Associated X protein，Bax）抗体（美国Abcam公司），增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL） 试 剂盒（英国Ameshame公司），Trizol试剂（美国Thermo Fisher Scientific公 司 ），miRNeasy Mini Kits、miScript逆转录试剂盒（德国Qiagen公司），Prime ScriptTMRT reagent kit（日本Takara公司），TaqMan®Universal PCR Master Mix II（美国Biosystems公司）。

1.2 细胞培养与给药处理 HOS细胞于含有5% CO2、饱和湿度、37 ℃的培养箱中，在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中进行培养。HOS细胞分为NC组（未处理）、Pro-L组（1 μg/mL异丙酚）、Pro-M组（5 μg/mL异丙酚）和Pro-H组（10 μg/mL异丙酚）。其中异丙酚以少量二甲基亚砜助溶，并用培养基进一步稀释，作用时间为48 h。

1.3 细胞转染与分组 将HOS细胞接种在6孔板中，细胞密度达到30%～50%时，按照Lipofectamine 2000的说明转染细胞。使用无血清的 Opti-MEM（250 μL）稀释miR-506 mimic、miR-506 inhibitor抑制剂和miR-NC，最终浓度为50 nmol/L，然后混合并在室温下孵育5 min。另 用250 μL无 血 清Opti-MEM稀 释5 μL Lipofectamine 2000，混合并在室温下孵育5 min。将上述两种溶液混合并在室温下孵育20 min，然后加入HOS细胞培养孔中。在37℃和5% CO2中孵育6～8 h之后，将HOS细胞在完全培养基中进一步培养24 h。转染miR-506 inhibitor和anti-miR-NC的细胞另加入10 μg/mL异丙酚作用48 h。将HOS细胞分为miR-NC组（转染miR-NC）、miR-506组（转染miR-506 mimic）、Pro+anti-miRNC组（转染anti-miR-NC+10 μg/mL异丙酚）和Pro+anti-miR-506组（转染miR-506 inhibitor+10 μg/mL 异丙酚）。

1.4 细胞增殖测定 收集1.2和1.3处理的HOS细胞，并根据制造商的方案使用细胞计数试剂盒8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）进行分析。将HOS细胞以3×103个/孔的密度接种到96孔板中，并将CCK-8试剂（10 μL/孔）添加到无血清的培养基中（90 μL/孔），并在37 ℃下与HOS细胞孵育3 h。使用酶标仪测量450 nm处的光密度值，以此反映HOS细胞增殖情况。

1.5 免疫印迹实验（Western blotting） 使用RIPA裂解液从HOS细胞中提取总蛋白。将经过上样处理的蛋白添加到采样孔（每孔约20 μg），在10%分离胶（120 V）上分离蛋白约2 h，转移到硝酸纤维素膜（30 V电转12 h）上。封闭后，将膜洗涤并与抗Cyclin D1（稀释比为1∶1 000）、抗p21（稀释比为 1∶1 000）、抗 MMP-2（稀释比为 1∶1 000）、抗 MMP-9（稀释比为 1∶1 000）、抗 Bcl-2（稀释比为1∶1 000）、抗Bax（稀释比为1∶1 000）和抗GAPDH（1∶2 500）抗体一起孵育于4 ℃过夜。将膜洗涤并与辣根过氧化物酶（HRP）标记的免疫球蛋白G（IgG）二抗（稀释比为1∶2 000）在37 ℃下孵育4 h。混合等量ECL试剂盒溶液，避光条件下添加到膜中进行着色。使用凝胶成像分析系统进行条带的光密度分析，Gel Doc XR成像仪系统和Quantity One软件分析目标蛋白与内部参照GAPDH的灰度值比，将其视为目标蛋白的表达。

1.6 迁移侵袭测定 将制备的Matrigel基质胶铺（侵袭测定）/不铺（迁移测定）在Transwell顶部室中。HOS细胞处理结束后，重悬于无血清的RPMI 1640培养基中，并在顶部室中添加200 μL细胞悬浮液（5×104个细胞）。在底部室中添加500 μL含血清的RPMI 1640培养基。培养24 h后，用70%乙醇将Transwell室固定15 min，结晶紫染色15 min，室温下干燥，显微镜下随机选择至少3个视野计数，以其平均值作为细胞侵袭/迁移能力的指标。

1.7 细胞凋亡分析 Annexin V-异硫氰酸荧光素（FITC）/PI双重染色用于检测HOS细胞凋亡。HOS细胞处理结束后，根据美国BioVision的Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒的说明，使用Annexin-V-FITC和PI染色。通过流式细胞仪检测FITC和PI荧光来分析细胞凋亡情况。

1.8 荧光定量PCR测定 使用Trizol试剂分别从HOS细胞中提取总RNA。miRNeasy Mini Kits分离miRNA。随后，使用miScript逆转录试剂盒通过逆转录获得cDNA。使用TaqMan®Universal PCR Master Mix II进行PCR。所用引物如下：miR-506，正向 5’-TAAGGCACCCTTCTGAGTAGA-3’，反向 miR-506 5’-GCGAGCACAG AATTAATACGAC-3’；U6，正向 5’-CTCGCTTCGF GCAGCACA-3’，反向 5’-AACGCTTCACGAATTT GCGT-3’。miR-506 表达根据 2-ΔΔCt法通过 U6 进行标准化。

1.9 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计分析，数据以表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间进一步两两比较采用SNK-q检验；两组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度异丙酚对骨肉瘤HOS细胞增殖的影响 与NC组比较，Pro-L、Pro-M、Pro-H组HOS细胞抑制率逐渐增加，Cyclin D1蛋白水平逐渐降低，而p21蛋白水平逐渐升高，呈一定的浓度依赖性，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1、表1。

图1 增殖相关蛋白表达

表1 异丙酚对骨肉瘤HOS细胞增殖的影响

2.2 异丙酚对骨肉瘤HOS细胞迁移侵袭和凋亡的影响 相比于NC组，Pro-L、Pro-M、Pro-H组HOS细胞的迁移细胞数、侵袭细胞数、MMP-2、MMP-9和Bcl-2蛋白水平均逐渐降低，Bax蛋白水平和凋亡率逐渐升高，呈一定的浓度依赖性，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2、表2。

图2 异丙酚对骨肉瘤HOS细胞迁移侵袭和凋亡的影响

表2 异丙酚对骨肉瘤HOS细胞迁移侵袭和凋亡的影响

2.3 异丙酚对骨肉瘤HOS细胞中miR-506表达的影响 Pro-L、Pro-M、Pro-H组HOS细胞中miR-506的表达水平均高于NC组，且呈一定的浓度依赖性，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 异丙酚对骨肉瘤HOS细胞中miR-506表达的影响

2.4 miR-506过表达对骨肉瘤HOS细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的影响 同miR-NC组比较，miR-506组HOS细胞中miR-506表达水平、抑制率增加，迁移细胞数、侵袭细胞数减少，凋亡率增加，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白水平降低，p21、Bax蛋白水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见图3、表4。

图3 miR-NC与miR-506组增殖、迁移侵袭和凋亡相关蛋白表达

表4 miR-506过表达对骨肉瘤HOS细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的影响

2.5 抑制miR-506表达逆转了异丙酚对骨肉瘤HOS细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的作用 与Pro+anti-miR-NC组 比 较，Pro+anti-miR-506组HOS细胞中miR-506表达水平、抑制率减少，迁移、侵袭细胞数增加，凋亡率减少，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白水平升高，p21、Bax蛋白水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图4、表5。

图4 Pro+anti-miR-NC与Pro+anti-miR-506组增殖、迁移侵袭和凋亡相关蛋白表达

表5 抑制miR-506表达逆转了异丙酚（10 μg/mL）对骨肉瘤HOS细胞增殖、迁移和侵袭的作用

3 讨论

异丙酚已被广泛用于治疗各种疾病，多项研究报道它具有抗癌作用[12-13]。Zhang等[11]揭示，异丙酚在骨肉瘤中表现出突出的抗增殖和抗转移活性，并能够在体外加速细胞凋亡。异丙酚通过调节miR-137和成纤维细胞生长因子9抑制人黑素瘤细胞的增殖、侵袭和迁移[14]。异丙酚通过下调miR-374a抑制肝癌细胞系的增殖、迁移、侵袭，并促进细胞凋亡[15]。本研究结果表明，1、5、10 μg/mL异丙酚在HOS细胞中以浓度依赖方式降低了细胞增殖及迁移侵袭，并诱导了细胞凋亡。此外，异丙酚显著上调了p21、促凋亡蛋白Bax的表达水平，并下调了CyclinD1、MMP-2、MMP-9、抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。这些数据表明，异丙酚可能在骨肉瘤细胞的生长和转移中起关键作用，具有一定的抗骨肉瘤活性。然而，异丙酚发挥抗骨肉瘤的潜在分子机制需要进一步研究。

许多不同的癌症显示出miR-506的失调[16-17]。通过调节癌细胞的生长，miR-506被认为是多种细胞功能的重要调节剂。miR-506充当抑癌因子还是致癌因子取决于不同的肿瘤类型[18]。一方面，结肠癌组织中观察到miR-506的表达水平高于癌旁正常结肠黏膜组织[19]，miR-506在皮肤鳞状细胞癌组织和细胞系中均上调，能够促进皮肤鳞状细胞癌的恶性增殖和转移[20]。另一方面，miR-506的表达水平在骨肉瘤中均低于正常对照，具有抑制骨肉瘤细胞增殖的作用[21]。miR-506表达在膀胱癌、甲状腺乳头状癌组织和细胞系中下调，miR-506过表达导致膀胱癌、甲状腺乳头状癌细胞增殖、侵袭或迁移减弱[22-23]。肝癌组织和细胞中miR-506水平显著下调，miR-506下调促进了肝癌HepG2和Hep3B细胞的增殖并阻止了凋亡[24]。可见miR-506是骨肉瘤、膀胱癌、肝癌、甲状腺乳头状癌等肿瘤的抑制剂。本实验结果表明，miR-506过表达后，HOS细胞的增殖、迁移侵袭、CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2 蛋白水平被降低，凋亡、p21、Bax蛋白水平则被提高，提示与前述报道[17-20]相符，miR-506是骨肉瘤中的抗癌因子，参与骨肉瘤细胞生长与转移进程。

某些麻醉剂已被证明在通过miRNA发挥对人类癌症的调节作用，包括骨肉瘤[25]。Yu等[26]证明，异丙酚通过下调miR-24诱导乳腺癌细胞凋亡。异丙酚通过抑制miR-21表达来抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖和上皮-间质转化[27]。本研究表明，1、5、10 μg/mL异丙酚诱导了骨肉瘤细胞HOS中miRNA异常表达，即异丙酚处理在HOS细胞中以浓度依赖的方式上调miR-506的表达。相反，抑制miR-506表达消除了异丙酚对骨肉瘤细胞生长和转染的抑制作用，表现为抑制miR-506表达后，异丙酚减弱HOS细胞增殖、迁移侵袭和增强其凋亡的功能被逆转。这些数据证实，异丙酚可能通过上调人骨肉瘤细胞中的miR-506表达而降低细胞增殖、迁移侵袭并诱导凋亡。

综上，本研究结果表明，1、5、10 μg/mL异丙酚发挥抗癌作用，以防止骨肉瘤发生发展。在人骨肉瘤细胞中，异丙酚以浓度依赖的方式减轻细胞增殖、迁移侵袭，并诱导了细胞凋亡和异常的miRNA表达，且miR-506参与了异丙酚诱导的抗癌机制。这些为异丙酚诱导人骨肉瘤恶性细胞过程的分子机制提供了新颖的见解。