参苓白术散通过“肠-肝”轴影响胆囊胆固醇结石形成的机制探究

王 红，曲鹏飞，邓为民，韩俊泉，杨景明，张雨田，杨朝帅，王悦豪，冯彬彬，李慧臻

胆固醇结石病是临床常见的疾病之一，我国普通人群胆石病的患病率为l0%左右，其发病率呈逐年上升趋势[1]。目前超过80%的胆石症患者为胆囊胆固醇结石[2]。胆固醇结石属于常见病，但其在治疗方面仍存在很多问题，如药物溶石、体外超声波碎石不彻底；保胆取石术容易复发[3]。因此预防胆固醇结石的产生，具有很强的实际需要及社会经济价值。

胆固醇结石发生与胆汁胆固醇水平有密切关系[4-5]。近些年发现，小肠（肠-肝轴）对胆汁中胆固醇有重要影响。小肠吸收的胆固醇大量转运至肝，继而转运至胆汁，胆汁中胆固醇过饱和并破坏“三角关系”[6]，导致胆固醇结石形成。

中医药在治疗胆结石尤其是胆囊胆固醇结石方面显示出了很好的临床疗效[7-9]，并围绕“胆病从肝论治”，从“土壅木郁”理论入手探讨胆固醇结石防治的新策略。现代医学证实小肠的消化吸收等大部分功能属中医“脾主运化“范畴，脾五行属土，肝主疏泄归于木，二者遵循五行克复乘侮规律，肠-肝（胆）途径的胆石发病符合的“脾虚湿胜、土壅木郁反克肝木”的病机演变模式。因此，探讨中药如何调控肠-肝轴胆固醇代谢、调控胆道运动的效应及机制，将是预防胆石病发生的新方法。本研究通过观察其对小肠组织Niemann-Pick C1样蛋白1（NPC1L1）、肝组织中B1型清道夫受体(SRB1)、胆囊收缩素(CCK)信号通路的影响，为“土壅木郁”理论从“肠-肝”轴治疗、预防胆固醇结石提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性普通级Hartley豚鼠，12周龄，体质量250～300 g，由北京隆安实验动物养殖中心提供，合格证号：SCXK(京)2014-0003。动物饲养于天津市医药科学研究所。高脂饲料（10%猪油、0.5%胆固醇、89.5%基础饲料）及普通饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供。

1.2 药物 参苓白术散（批号：20160401，规格：6 g/100粒，山东方健制药有限公司）；依折麦布片（批号：ZEZPA16001，规格：10 mg/片，MSD Pharma (Singapore) Pte. Ltd.）。

1.3 试剂与仪器 血清总胆固醇（TC，批号：822RBO）；三酰甘油（TG，批号：826RCO）；低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C，批号：824RLN）；高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C，批号：823RAO）生化检测试剂盒购自中国积水医疗科技有限公司。总胆汁酸测定试剂盒及蛋白定量测试盒购自南京建成生物工程研究所。NPC1L1购自生工生物工程(上海)股份有限公司。SRB1、CCK试剂盒均购自上海蓝基生物科技有限公司。KHB ST-360型酶标仪（上海科华生物工程股份有限公司）；BX53型偏光显微镜、DP73型显微镜摄像头、SZ2-STS型体视显微镜（日本OLYMPUS公司）。

1.4 分组、造模及给药 雄性普通级Hartley豚鼠60只，适应性喂养1周，随机分为对照组、模型组、依折麦布组、参苓白术散高、中、低剂量组，每组10只。对照组予普通饲料，其余组均予高脂饲料，在室内温度20～25℃，相对湿度40%～70%，明暗周期12 h/12 h条件下喂养8周，建立胆固醇结石模型。造模4周后，开始药物灌胃干预，给药剂量10mL/kg。依折麦布组予依折麦布混悬液1 mL/kg，参苓白术散高、中、低剂量组分别予参苓白术散0.85、8.5、17 g/kg，模型组和对照组予等体积生理盐水，1次/d，连续4周。期间各组动物自由饮水摄食。

1.4 取材 末次给药后，各组禁食不禁水12 h，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，静置30 min 后，3 000r/min离心10 min，-80 ℃冻存备用；取肝组织、末端回肠、远端空肠，-80℃保存，另取肝组织用10%中性福尔马林固定，行组织病理学HE染色观察；结扎胆囊管并完整取下胆囊，收集胆囊胆汁并观察成石情况，并测定胆囊胆汁。

1.5 指标检测及方法

1.5.1 血生化检测血清TC、TG 使用全自动生化分析仪检测各组豚鼠血清中TC、TG的含量。

1.5.2 胆囊胆汁胆固醇、总胆汁酸测定 胆汁保存于-20 ℃。采用酶比色法，磷脂测定采用酶显色法，按试剂盒说明进行测定。

1.5.3 HE染色观察肝脏组织形态学变化 将肝脏组织置于10%中性甲醛溶液固定24 h，逐级乙醇脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，采用HE染色法，光镜下观察肝组织病理形态学变化。

1.5.4 胆囊胆固醇结晶及结石鉴定结石判断标准 肉眼观察胆汁内有成形粗大颗粒；细针穿刺胆囊吸取胆汁，滴少量于载玻片上制成胆汁涂片，在OLYMPUS BX53型偏光显微镜，配OLYMPUSDP73型显微镜摄像头观察。胆固醇结晶定量标准：取部分新鲜胆囊胆汁离心，沉淀物涂片，光镜下观察有无胆固醇结晶。

1.5.5 酶联免疫吸附法测定小肠组织NPC1L1、肝组织中SRB1和CCK的表达 取各组动物小肠及肝组织，提取组织裂解液，严格按照酶联免疫吸附法（ELISA）检测。

1.6 统计学方法 数据用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，两样本均数比较采用t检验，多个样本均数间比较采用单因素方差分析；多个样本率比较采用χ2检验；相关分析采用Pearson相关；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝脏及胆囊肉眼外观及显微镜下外观 正常组豚鼠肝脏外观呈暗红色，质地柔软，胆囊内胆汁透明清亮，无颗粒状物质存在。而模型组豚鼠肝脏可见点状脂肪沉积，胆囊内胆汁浑浊，可见多个黑色颗粒沉积。依折麦布组胆囊内胆汁较澄明，无沉积物；参苓白术散中、高剂量组肝脏无明显点状脂肪堆积，胆囊内胆汁澄明，无沉积物；参苓白术散低剂量组肝脏体积、外观、质地较模型组略有好转，但胆囊内胆汁较浑浊。见图1。

图1 各组豚鼠的肝脏及胆囊外观

2.2 体视显微镜下胆囊中结石情况 参苓白术散各组和依折麦布组的结石发生情况明显少于模型组，依折麦布组和参苓白术散高剂量组效果最好，成石最少，见图2。

图2 显微镜下各组豚鼠胆囊中胆汁成石情况

2.3 胆汁胆固醇结晶 对照组豚鼠胆囊胆汁内未见胆固醇结晶，模型组胆汁内可见典型的胆固醇针状结晶；依折麦布组胆汁内胆固醇结晶稀少；参苓白术散中、高剂量组胆汁内胆固醇结晶较模型组明显减少，参苓白术散低剂量组胆汁内胆固醇结晶有减少趋势。见图3。

图3 偏振光显微镜下各组豚鼠胆汁胆固醇结晶情况

2.4 肝脏病理组织学观察 对照组肝脏组织基本正常；模型组可见弥漫性大泡性脂肪变，肝组织内广泛的肝细胞气球样变、少量炎细胞浸润和点状细胞坏死；依折麦布组脂肪变性显著减轻；参苓白术散中、高剂量组脂肪变性及肝细胞气球样变显著减轻；参苓白术散低剂量组肝细胞脂肪样变性改善较模型组不明显。见图4。

图4 各组豚鼠肝组织HE染色（×200）

2.5 各组豚鼠血清中TG、TC及胆汁总胆固醇、总胆汁酸水平比较 与对照组相比，模型组豚鼠TC、TG含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，参苓白术散高、中剂量组及依折麦布组TC、TG含量均下降（P＜0.01）。与对照组相比，模型组的总胆汁酸、总胆固醇含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，参苓白术散低剂量组总胆汁酸、总胆固醇未见明显下降，而参苓白术散中、高剂量组与依折麦布组的总胆汁酸、总胆固醇明显下降（P＜0.01），见表1。

表1 各组豚鼠血清TG、TC及胆汁总胆固醇、总胆汁酸水平比较

2.6 各组豚鼠空肠组织NPC1L1、肝组织SRB1、CCK受体表达水平比较 与对照组比较，模型组NPC1L1、SRB1表达明显升高，CCK明显下降（P＜0.01）；与模型组比较，参苓白术散高、中剂量组NPC1L1、SRB1表达显著降低（P＜0.01）；参苓白术散高剂量组和依折麦布组的CCK均较模型组升高（P＜0.01），见表2。

表2 各组豚鼠小肠组织中NPC1L1、肝组织中SRB1、CCK受体表达水平比较

3 讨论

历代中医学文献中并无“胆囊胆固醇结石”病名，胆囊胆固醇结石是现代医学病名。普遍认为胆石症病机基于“胆病从肝论治”的疏肝理气、疏肝化瘀、疏肝利胆、清热利胆”等方法的研究取得了许多成果[10-11]。而胆汁中胆固醇过饱和造成胆囊结石的中医病机过程是一个“肝郁脾虚、土壅木郁”互为因果（肠-肝互动）的动态过程。五脏分属五行，其中脾主运化而归属于土，肝主疏泄而归于木。《素问·至真要大论》中记载“湿淫所胜”的脾虚生湿，湿邪壅塞之脾土太过，反侮肝木之证。基于脾虚湿郁、土壅木郁在一定阶段起着重要的作用，所以此机制也不容忽视[12]。

而现代医学中小肠的消化吸收等大部分功能属中医“脾脏主运化”（一为运化精微，一为运化水液）功能范畴，另外现代医学中肝分泌、影响胆汁的排泄也在中医“肝主疏泄”范围内[13]，所以肠-肝轴途径的胆石发病机制比较符合中医的“肝郁脾虚木胜克土、土壅木郁反克肝木”互为因果的病机演变模式，这是客观存在的[14]。而对于治疗“湿淫所胜”导致的湿邪壅塞之脾土太过反侮肝木之证，治法宜健脾渗湿，而参苓白术散作为健脾渗湿的经典方剂，用来治疗“土壅木郁”引发的疾病比较恰当。

胆固醇结石的发生与胆固醇代谢异常关系密切，其中主要涉及到肝脏、胆囊、肠道。人体胆固醇来源主要为肠道吸收和肝脏合成。小肠道吸收肠腔中食物及胆汁中的胆固醇进入人体，此过程需要小肠上皮细胞刷状缘上的NPC1L1参与，当NPC1L1介导的胆固醇进入人体后通过血液循环到达肝脏，在肝细胞基底膜的表达的SRB1摄取血浆中的胆固醇进行肝脏的胆固醇代谢，然后肝脏再通过胆汁将胆固醇排入小肠。而部分肝脏分泌的胆汁进入胆囊，通过胆囊收缩排入小肠。

NPC1L1在小肠吸收胆固醇过程中非常重要，小肠中的胆固醇酯水解为游离胆固醇后，需要通过NPC1L1才能进入吸收细胞，最后进入淋巴循环。Altmann等[15]发现NPC1L1基因敲除小鼠与正常小鼠对比，NPC1L1缺陷小鼠的小肠血浆中及胆囊中胆固醇水平下降，小鼠胆囊成石率降低。

HDL-C是人体胆汁中胆固醇的主要来源[16]，当SRB1在肝细胞中表达水平升高会造成胆汁中的胆固醇过饱，引起胆结石形成[17]。有研究发现，相比于对照组患者，胆石症组患者的SRB1表达明显上升。而SRB1表达缺陷的小鼠其血浆胆固醇水平增加，胆汁胆固醇水平降低[18-19]。

胆囊运动迟滞的初期导致胆汁淤积，而在后期会使胆固醇结晶排出障碍，胆固醇结晶逐渐堆积形成结石[20]。而胆囊的运动主要依靠肠道黏膜分泌CCK、胃动素与胆囊相关受体结合[21-22]。当十二指肠和空肠黏膜释放CCK的量减少，会引起胆囊运动减弱。而胆囊运动迟滞导致胆囊易析出胆固醇结晶、胆囊排出胆固醇结晶障碍，使得胆石症发生概率变大[23]。

与模型组相比，参苓白术散低、中、高剂量组豚鼠NCP1L1水平上升，CCK、SRB1表达均下降，其中中、高剂量组变化显著（P＜0.01）。同时中、高剂量参苓白术散组血浆TC、TG、LDL-C均下降，HDL-C升高，胆汁总胆固醇明显下降（P＜0.01）。模型组可见明显胆汁胆固醇结晶，而依折麦布和参苓白术散低、中、高剂量组结晶稀少，其中，参苓白术散中、高剂量组的结晶明显减少。模型组的肝脏病理出现明显脂肪变性，胆囊内胆汁更加黏稠，而参苓白术散组的肝脏病理脂肪变性不明显，胆囊内胆汁更加澄明，无沉积物。表明参苓白术散可能通过抑制豚鼠小肠上NCP1L1表达来降低小肠对胆固醇的吸收，使得进入肝脏脂代谢的胆固醇减少；降低肝脏中SRB1的表达水平，使得肝细胞减少从血浆中摄取胆固醇，降低肝脏的脂肪变，肝脏进而减少通过胆汁向小肠排泄胆固醇；促进小肠分泌CCK从而刺激胆囊运动，减少胆固醇结石产生。参苓白术散通过“肠-肝”轴途径来缓解胆汁中胆固醇过饱和的情况，最终降低胆石症发生率。

综上所述，参苓白术散可以抑制小肠吸收胆固醇、减轻肝细胞对胆固醇摄取、促进胆囊运动，最终缓解胆汁胆固醇过饱和情况减少胆囊中胆固醇结石形成。推测上述效果主要是参苓白术散作用于“肠-肝”轴，即抑制上小肠上皮刷状缘NPC1L1、肝细胞SIRB1，促进小肠分泌CCK作用于胆囊有关，但可能还有其他作用靶点，还需要进一步研究。