应用脑脊液分离病原菌短期培养物构建快速检测流程的研究

李方强，郑光辉，张艳，张国军

作者单位：100070 北京，首都医科大学附属北京天坛医院实验诊断中心/国家药监局体外诊断试剂质量控制重点实验室/北京市免疫试剂临床工程技术研究中心

中枢神经系统感染是一类由于病原微生物侵犯中枢神经系统的实质、被膜以及血管而引起的急慢性炎症，是院内常见、严重的并发症之一，可导致严重的后遗症，甚至危及患者的生命[1-2]。传统病原学诊断方法需要将阳性脑脊液培养液转种到固体培养基上，过夜孵育以得到足够的单个菌落来进行细菌鉴定和药敏试验，但整个过程耗时漫长。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight-mass spectrometer，MALDI-TOF MS）是近些年发展起来的一种细菌鉴定技术，可快速完成细菌鉴定[3]。在此基础上，研究者们还尝试了很多将鉴定过程进一步提速的方案，如直接对阳性培养物进行洗涤离心、过滤等，富集蛋白以直接质谱鉴定[4]。但这些方案往往过程较为复杂，或容易产生额外成本。本研究探讨了利用脑脊液阳性培养液转种后的短期培养物，直接质谱鉴定，并开展快速药敏试验的方案，与常规质谱鉴定加常规药敏试验的结果比较，验证该方案的可行性，以构建新的检测流程。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 收集 2018年11月–2019年10月北京天坛医院脑脊液培养阳性样本 216 例，培养液经革兰染色后证实为单一细菌感染，仅保留患者第一次脑脊液培养阳性样本。质控菌株为大肠埃希菌 ATCC 8739、金黄色葡萄球菌 ATCC 29213、大肠埃希菌 ATCC 25922。

1.1.2 仪器与试剂 Bact/Alert 3D 培养仪、VITEK-MS 质谱分析仪、VITEK-2 Compact60 鉴定药敏仪、Bact/Alert PF 儿童血培养瓶、基质液CHCA、GN09 药敏卡、GP67 药敏卡均购自法国生物梅里埃公司；哥伦比亚血琼脂平板购自美国赛默飞世尔公司。仪器均经过定期校准，试剂在效期内使用。

1.2 方法

1.2.1 脑脊液培养阳性标本短期培养物鉴定 使用一次性无菌注射器抽取少量阳性培养液（20～50 μl）转种于哥伦比亚血琼脂平板上，平板置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育。5.5 h 后观察菌膜形成情况，使用 1 μl 接种环刮取少量菌膜，均匀涂布于靶板靶点上。加 1 μl CHCA 基质液，待自然干燥结晶后上机进行质谱分析。鉴定结果与继续过夜孵育 24 h 后菌落质谱鉴定结果比较。菌株数据库使用厂家配套的最新版本 VITEK-MS IVD软件。如果 MALDI-TOF MS 鉴定两个时间点均失败，则通过 16S rRNA 基因序列分析方法鉴定微生物。

1.2.2 短期培养物药敏试验 同时刮取孵育 5.5 h后的菌膜，配置 0.5 麦氏浊度菌悬液。根据菌膜质谱鉴定结果，革兰氏阴性菌选择 VITEK GN09 药敏卡、革兰氏阳性菌选择 VITEK GP67 药敏卡，使用 VITEK-2 Compact60 全自动鉴定药敏仪进行药敏试验。其结果与继续过夜孵育 24 h 后菌落常规药敏试验结果比较。药敏试验结果使用仪器配套的 CLSI M100-S28 专家规则判读。对于每种抗菌药物，两者结果相同记为一致；若耐药菌株检测为敏感，则记为重大差异；若敏感菌株检测为耐药，则记为主要差异；若中介菌株检测为敏感或耐药、敏感或耐药菌株检测为中介，则记为微小差异[5]。按照 CLSI M52 商品化微生物鉴定及药物敏感性试验系统指南要求来评估两种方法的一致性。

2 结果

2.1 短期培养物鉴定结果

本研究共纳入 216 例脑脊液培养阳性样本，其中，革兰氏阴性菌 81 例，革兰氏阳性菌 131 例，真菌 4 例。利用短期培养物进行 MALDI-TOF MS鉴定的总体正确率达到 90.7%。其中，常见革兰氏阴性菌鉴定正确率达到 94.9%，1 株肺炎克雷伯菌、1 株鲍曼不动杆菌、1 株铜绿假单胞菌和 1 株嗜麦芽窄食单胞菌短期培养后未获得鉴定结果，过夜培养 24 h 后鉴定正确。常见革兰氏阳性菌鉴定正确率为 89.4%，1 株表皮葡萄球菌短期培养法后错误鉴定为溶血葡萄球菌，6 株表皮葡萄球菌、1 株人葡萄球菌、1 株头状葡萄球菌、2 株沃氏葡萄球菌、2 株肺炎链球菌和 2 株纹带棒状杆菌短期培养法后未获得鉴定结果，具体结果见表 1。

表1 MALDI-TOF MS 鉴定短期培养物结果Table 1 The results of MALDI-TOF MS identification using short-term cultures

2.2 革兰氏阴性杆菌短期培养物药敏结果

革兰氏阴性杆菌利用短期培养物进行药敏试验与常规方法药敏试验的一致性为 99.7%，微小差异、主要差异、重大差异分别为 0.1%、0.2%、0.0%。其中，产生差异的抗生素有头孢他啶、左氧氟沙星。革兰氏阴性杆菌药敏试验结果见表 2。

表2 革兰氏阴性杆菌短期培养药敏试验与常规药敏试验一致性结果Table 2 The results of short-term culture drug sensitivity test of gram-negative bacilli were consistent with those of routine drug sensitivity test

2.3 革兰氏阳性球菌短期培养物药敏结果

革兰氏阳性球菌利用短期培养物进行药敏试验与常规方法药敏试验的一致性为 99.4%，微小差异、主要差异、重大差异分别为 0.3%、0.1%、0.3%。其中，产生差异的抗生素有红霉素、青霉素、氨苄西林、克林霉素以及复方新诺明。革兰氏阳性球菌药敏试验结果见表 3。

表3 革兰氏阳性球菌短期培养药敏试验与常规药敏试验一致性结果Table 3 The results of short-term culture drug sensitivity test of gram-positive cocci were consistent with those of routine drug sensitivity test

3 讨论

神经外科术后导致的中枢神经系统感染一直是我院临床抗感染治疗中关注的重点问题。患者一旦形成颅内感染，往往病情发展迅速，病死率高[1-2]。传统病原学诊断方案耗时较长，完成培养、鉴定和药敏流程，回报临床结果一般需要 3～5 d 的时间，导致临床科室使用抗菌药物治疗通常为经验用药。而不同的科室其分布的细菌、耐药性都有差异[6]，使得抗生素的使用也出现偏差，会导致患者住院日延长、医疗费用增加，甚至死亡率上升等不良后果[7]。

MALDI-TOF MS 技术作为一种新兴技术，在微生物鉴定领域取得了极大的成绩，该技术的应用大大改进并加速了常规微生物学诊断，比传统生化反应鉴定方法有更好的表现，单个测试的试剂成本也更为低廉[8-10]。在既往的诸多研究中，研究者们还尝试了通过对阳性培养液进行前处理，如多步洗涤离心、过滤、真空采血管离心、商业化处理试剂盒等多种方案来进一步缩短血液或无菌体液阳性培养物的鉴定时间[11-14]。但是这些方法操作流程相对复杂，涉及多个步骤，或增加额外成本，难以整合到正常试验流程中去。而本研究所采用的方案将脑脊液阳性培养物在固体培养基上进行非常短暂的培养，形成菌膜，使用质谱技术鉴定，进行快速药敏试验，可以较好地整合到实验诊断流程中，不需要额外的成本消耗、时间花费或特殊经验，能够更好地减少培养瓶中活性炭和各类杂蛋白对质谱鉴定的影响，唯一不同的工作步骤是更早地观察转种后的琼脂平板，到达短期培养时间点后即可开始日常 MALDI-TOF MS 操作程序、药敏试验操作步骤。可以在质谱技术缩短细菌鉴定时间的基础上进一步压缩检测周转时间，将微生物鉴定报告的周期缩短 18～42 h。

根据国内外相关研究报道[15-17]，以及本研究前期预实验结果，我们综合考虑了转种后革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌形成可鉴定菌膜的时间，以及构建快速鉴定药敏流程的易操作性，最终选定了 5.5 h这一个短期培养时间点。本研究中，脑脊液阳性样本利用短期培养质谱鉴定与过夜培养质谱鉴定的符合率可达到 90.7%，其中常见革兰氏阴性菌更高达 94.9%。同时，我们发现革兰氏阳性菌的鉴定符合率要低于阴性菌，与李媛睿等[18]的报道基本一致，可能由于链球菌属、棒状杆菌属细菌生长相对缓慢，不能获得足量的蛋白信号进行分析，可以根据革兰染色镜下形态协助提前判断，适当延长培养时间以得到足够菌膜。另外，提前采用 0.5 μl 甲酸处理菌落，可更好地破坏阳性菌胞壁，充分暴露出核糖蛋白，增加鉴定成功率。

为了解决常规药敏试验耗时长、报告慢、指导临床用药不及时的问题，本研究还对脑脊液培养中的常见菌进行了短期培养物 MIC 法药敏试验。与常规药敏试验方法相比，革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌药敏结果一致性为 99.7%、99.4%，报告时间可缩短 24 h。其中革兰氏阴性菌结果与其他类似研究相比，表现为本研究一致性较高[19]。我们分析原因为本院术后颅内感染的患者往往病情较重，多为ICU 病房患者，发生院内感染的概率很高。本研究纳入病例分离到的革兰氏阴性菌多为泛耐药的肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌，占比达到 72.7%，药敏试验多数抗生素均为耐药，导致两种方法结果无各类差异。这也是本研究的不足之处，结果不够全面，日后应进一步扩大样本量和菌种多样性。

综上所述，本研究探讨了从含有活性炭成分培养瓶中得到脑脊液阳性培养物，转种至固体培养基上短期培养，进行质谱鉴定和快速药敏的可行性很高。两者的结合能够使微生物室工作流程进一步优化，显著缩短检测周转时间，有助于临床更快速、准确地获得病原学证据，改善患者预后、降低医疗费用，对减少耐药菌有积极的意义，产生重要的临床应用价值[20]。