BRCA基因突变检测的标准化研究

曲守方，黄传峰，张文新，孙楠，于婷，黄杰

作者单位：100050 北京，中国食品药品检定研究院非传染病诊断试剂室（曲守方、张文新、孙楠、于婷、黄杰）；理化检测室（黄传峰）

乳腺癌和卵巢癌是女性发病率和死亡率较高的恶性肿瘤，5%～10% 的乳腺癌患者和 10%～15% 的卵巢癌患者为家族性或遗传性癌症。这两种家族性或遗传性癌症与乳腺癌易感基因 1（breast cancer susceptibility gene 1,BRCA1）和乳腺癌易感基因 2（BRCA2）的突变密切相关[1-2]。BRCA1 基因定位于 17q21，含有 23 个外显子，编码 1863 个氨基酸；BRCA2 基因定位于 13q13，含有 27 个外显子，编码 3418 个氨基酸[3]。BRCA1 和 BRCA2基因均为抑癌基因，编码蛋白通过同源重组通路修复双链 DNA，聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）通过碱基切除修复通路修复单链 DNA 损伤[4]，这两种 DNA 损伤修复机制缺陷会造成细胞基因组严重不稳定进而诱导细胞凋亡，影响基因组稳定性，并引起多种癌症的发生。携带 BRCA1/BRCA2 致病胚系突变的健康女性乳腺癌和卵巢癌的发病风险显著升高。BRCA 基因作为一种重要的生物标志物，可以用于女性乳腺癌、卵巢癌以及其他癌症发病风险的评估。PARP 抑制剂能靶向杀伤 BRCA1/2 缺陷的肿瘤细胞，具有 BRCA 有害突变的卵巢癌患者对铂类化疗更加敏感并且可以获益于 PARP 抑制剂的治疗[5-6]。因此检测 BRCA基因突变，确定肿瘤患者的药物敏感性，可以帮助临床医生选择个体化靶向药物治疗方案。

BRCA1 和 BRCA2 基因突变形式多样，而且突变位点散布于基因的整个编码区，但是没有热点突变，也没有热点区域。最常见的致病性突变为小片段缺失或插入或移码突变，也有剪切点突变及大片段基因重排现象，还包括错义突变、沉默突变及基因多态性等其他形式的突变，但临床如何解读这些位点的致病潜能仍有困难。BRCA1/2 基因突变检测方法有多种，包括 Sanger 测序、多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）、染色体微阵列分析（chromosomal microarray，CMA）或微阵列比较基因组杂交（array comparative genomic hybridisation，aCGH）等[7]。传统的一代测序结合 MLPA 检测大片段缺失/重复导致的重排不仅繁琐，而且成本高和通量低。随着下一代测序（next generation sequencing，NGS）技术的飞速发展，国内外越来越多的实验室已将 NGS 技术应用于 BRCA 基因变异的临床检测[8-10]。因此亟需有完善的标准化体系用于评估基于 NGS 的 BRCA基因突变检测试剂盒的性能。本研究使用 BRCA基因突变国家参考品，对 BRCA1/2 基因突变检测试剂盒（联合探针锚定聚合测序法）的性能进行评价，实现对BRCA基因突变检测的标准化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 BRCA基因突变国家参考品 包括 25 个样本，来源于基因编辑细胞系样本、有家族史的肿瘤患者或者携带者样本以及正常人样本，由中国食品药品检定研究院提供。

1.1.2 试剂 BRCA1/2 基因突变检测试剂盒（联合探针锚定聚合测序法）（以下简称试剂盒）购自华大生物科技（武汉）有限公司；Qubit dsDNA HS Assay Kit 和 Qubit ssDNA Assay Kit 购自美国Invitrogen 公司；测序反应通用试剂盒（联合探针锚定聚合测序法）购自华大生物科技（武汉）有限公司。

1.1.3 设备 Qubit 3.0 荧光定量仪购自美国Invitrogen 公司；PCR 仪购自美国 Applied Biosystems 公司；BGISEQ-500 基因测序仪购自深圳华大智造科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 文库的构建 取国家参考品的基因组DNA，按照试剂盒说明书的操作方法，经过打断和末端修复、接头连接、pre-PCR 扩增、BRCA 基因特异性探针杂交捕获以及 post-PCR 扩增等步骤进行 DNA 文库制备。使用 Qubit 3.0 荧光定量仪和Qubit dsDNA HS Assay Kit 进行 DNA 定量。

1.2.2 测序反应 根据文库浓度，等量混合后进行环化反应，制备 DNA 纳米球（DNA nanoball,DNB），用 Qubit ssDNA Assay Kit 和 Qubit 荧光定量仪，按照试剂盒说明书进行浓度测定。DNB 浓度 ≥ 8 ng/μl 为合格标准，对浓度低于 8 ng/μl 的DNB 需重新制备，对浓度高于 40 ng/μl 的 DNB需用 DNB 加载缓冲液 I 稀释到 20 ng/μl。然后放置芯片，进行 DNB 加载。使用测序反应通用试剂盒（联合探针锚定聚合测序法），在 BGISEQ-500基因测序仪上进行测序反应。将得到的原始下机数据使用遗传性 BRCA 基因分析注释软件分析，获得国家参考品的 BRCA 基因变异信息。

2 结果

2.1 准确性和特异性

BRCA基因突变国家参考品说明书规定按照BRCA 基因解读规则进行解读，将变异的临床意义分为5 类：Class5（致病突变，Pathogenic），Class4（疑似致病突变，Likely pathogenic），Class3（意义未明变异，VUS），Class2（疑似良性变异，Likely benign），Class1（良性变异，Benign）。而 Class5 和Class4 对于临床决策是不存在差异的。按照国家参考品说明书中的判定标准，对解读结果进行评判（表 1）。结果显示试剂盒能准确检出国家参考品样本中 BRCA基因突变位点，也没有检出其他非标示的致病性或疑似致病性突变位点；部分位点的试剂盒解读结果与标示解读结果有差异，但是不纳入解读错误，所有突变位点的解读结果正确，见表 2。

表1 判定标准Table 1 Determination criteria

表2 国家参考品的检测及突变解读结果Table 2 The detection and mutation interpretation result for national reference material

BRCA1:K1183R_1 样本为国家参考品第一个样本，结果显示该样本的 BRCA2 基因 11 号外显子（EX11）发生杂合缺失突变（c.5351delA），导致 p.Asn1784Thrfs*7 的突变，试剂盒的解读结果为疑似致病突变（Class4-Likely pathogenic），国家参考品标示的解读结果为致病突变（Class5-Pathogenic），根据表 1 判断该样本的解读结果是正确的，为 BRCA基因突变阳性；BRCA1 基因的 10 号外显子（EX10）发生p.Lys1183Arg 的突变，解读结果为良性变异（Class1-Non pathogenic）；BRCA1 基因的 10 号外显子（EX10）发生 p.Asp435Tyr 的突变，解读结果为意义未明变异（Class3-VUS）。而且除标示位点外，该样本未检出已知致病突变及疑似致病突变，符合特异性的要求，见图 1。

图1 BRCA1:K1183R_1 结果Figure 1 The result of BRCA1:K1183R_1

2.2 重复性

重复性是在测量条件保持不变的情况下，连续多次测量结果之间的一致性，是试剂盒重要的性能指标。使用同一批次试剂盒，平行检测 3 套国家参考品，每个样本的 3 次结果均一致，即样本的BRCA基因突变位点能准确检出，解读结果也是正确的，没有检出其他非标示的致病性或疑似致病性突变位点。

3 讨论

遗传性乳腺癌和卵巢癌综合征（HBOC）是一种肿瘤易感性综合征，主要由 BRCA1/2 基因致病变异引起。BRCA1/2 驱动的 HBOC 与多种类型癌症的风险增加是相关的，包括胰腺癌、前列腺癌和黑色素瘤等。研究报道携带 BRCA1 基因缺陷的女性罹患乳腺癌的终身患癌风险为 72%，罹患卵巢癌的终身患癌风险为 44%；携带 BRCA2 基因缺陷的女性罹患乳腺癌的终身患癌风险为 69%，罹患卵巢癌的终身患癌风险为 17%。具有 BRCA1/2 突变的卵巢癌患者可获益于 PARP 抑制剂的治疗。目前已经获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的PARP 抑制剂，包括奥拉帕利（olaparib，Lynparza）和鲁卡帕利（rucaparib，Rubraca）[11-12]。

虽然 BRCA1/2 基因序列较长，变异形式多样，但并不是所有的 BRCA 变异都会损伤蛋白质功能，绝大多数变异并不会增加个人患癌症的风险[13-14]。因此对于 BRCA基因突变检测产品的性能评价，不仅需要 BRCA 变异的准确检测，而且对 BRCA 变异的正确解读也是至关重要的环节，需要建立我国的 BRCA 变异检测的标准化体系。在 BRCA 变异的解读方面，美国医学遗传学和基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南[15]将 BRCA 变异分为 5 类（Class5～1），分别为致病突变、疑似致病突变、意义未明突变、疑似良性变异和良性变异。其中致病性突变（Class5）和疑似致病性的突变（Class4）可认为是有害变异，有害变异可获益于PARA 抑制剂类药物。尽管 ACMG 指南提供了指导性的意见和建议，但是变异解读需要依据各类信息（包括来自群体数据库、疾病数据库、文献和患者病史的信息）进行综合评判，因此准确定义这些变异的临床意义还面临着巨大的挑战。目前中国食品药品检定研究院建立的 BRCA基因突变国家参考品，不仅对试剂盒的方法进行评价，即要求试剂盒能够准确地检出变异；同时也评价生物信息分析流程和数据解读流程，要求试剂盒能够正确解读出该变异。本研究结果表明国家参考品能够评价基于NGS 平台的 BRCA基因突变检测试剂盒的性能，实现对 BRCA基因突变检测的标准化工作，具有重要的指导意义。