保存温度、时间和冻融次数对RNA样本浓度和纯度的影响

张汝倩，洪恩宇，于永波，任慧敏，耿迪，杨慧，王雅頔，周萍萍，鲁洁，郭永丽

作者单位：100045 北京，国家儿童医学中心（北京）首都医科大学附属北京儿童医院，北京市儿科研究所儿童耳鼻咽喉头颈外科疾病北京市重点实验室（张汝倩、洪恩宇、于永波、任慧敏、耿迪、杨慧、王雅頔、周萍萍、鲁洁、郭永丽）；儿童临床数据和样本资源库（洪恩宇、于永波、任慧敏、耿迪、杨慧、王雅頔、周萍萍、鲁洁、郭永丽）

RNA 在人类多种生理和病理过程中发挥着举足轻重的作用。近些年来，随着分子生物技术在生命科学、医学等方面的广泛应用，以 RNA 为靶标进行的组织及细胞的分子生物学研究较为广泛。在 RNA 的科学研究中，高质量 RNA可满足 RT-PCR、Northern blot、基因表达谱、转录组测序和阵列分析等生物学实验的研究需求[1-2]，所以能够获得具有生物活性及化学稳定的完整 RNA 分子至关重要。然而由于 RNA 自身结构特性[3]和环境中广泛分布的核糖核酸酶（Ribonuclease，RNase）[4]，从血液、组织或培养的细胞中抽提得到的 RNA 的稳定保存相对困难。

目前，有关 RNA 浓度和纯度的影响因素研究主要集中在提取方法、样本类型、储存温度和时间等方面，有文献报道不同的放置时间和温度会影响 RNA 提取的质量浓度，但保存时间对 RNA 的纯度影响各报道结论不统一[5-6]。根据临床检测和科研的需要，提取后 RNA 保存条件和时间对RNA 浓度和纯度的影响也同样非常重要。同时，我们查询文献发现提取后 RNA 的保存温度和放置时间对 RNA 的质量影响也有所不同[7-8]，不同浓度的 RNA 反复冻融对其浓度和纯度的影响也鲜有报道。所以，本文通过探讨不同浓度的 RNA 在 4 ℃ 及常温条件下放置不同时间，评估其对RNA 浓度和纯度的影响；另外，通过反复冻融不同浓度的RNA，研究不同浓度的 RNA 冻融次数对其浓度和纯度的影响，以期为临床检测和科学研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要设备 4 ℃ 和–80 ℃ 冰箱均为三洋产品；300 servies AE 生物安全柜和 NanoDrop 分光光度计均购自美国 Thermo 公司；1 L 便携式液氮罐、高速冷冻离心机均购自德国 Eppendorf 公司；OSE-Y10 电动组织研磨器购自美国 Qiangen 公司。

1.1.2 主要试剂 AllPrep DNA/RNA Mini Kit 购自美国Qiangen 公司；β-巯基乙醇等试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标本采集与总 RNA 提取

1.2.1.1 组织标本的留取 组织标本为首都医科大学附属北京儿童医院手术切除的患儿组织样本（神经母细胞瘤瘤体）3 例，在组织离体 30 min 内，采集组织标本大小约30 mg/份（共 5 份），并迅速置于液氮中保存，以上操作均为无菌操作，并已获取相关知情同意书。

1.2.1.2 总 RNA 提取 组织样本 RNA 的提取严格按照操作说明书操作，步骤如下：每 30 mg 组织样本加入0.6 ml 缓冲液 RLT 和 β-巯基乙醇混合液，组织研磨器破碎后离心，吸取上层匀浆至带有收集管的过滤柱中，离心，加入等体积 70% 乙醇，离心，再加入缓冲液 RW1、缓冲液 RPE 去除蛋白及残留乙醇，最后加 50 μl RNasefree water 溶解 RNA。

1.2.2 样本分组 ①不同浓度 RNA 4 ℃ 放置组：组织样本提取 RNA 后混匀稀释成浓度 C1（400 ng/μl）、C2（200 ng/μl）、C3（100 ng/μl）和 C4（50 ng/μl）分装于 RNase free 冻存管中并编号，4 ℃ 放置 0、6、12、24、48、72、96 及 168 h，行 RNA 浓度及纯度检测，每组 3 个重复样本。②不同浓度 RNA 常温放置组：组织样本提取 RNA后混匀稀释成浓度 C1（400 ng/μl）、C2（200 ng/μl）、C3（100 ng/μl）和 C4（50 ng/μl）分装于 RNase free 冻存管中并编号，常温放置 0、3、6、12、24、48、72、96 及 168 h，行 RNA 浓度及纯度检测，每组 3 个重复样本。③不同浓度 RNA 反复冻融组：组织样本提取 RNA 后混匀稀释成浓度 C1（400 ng/μl）、C2（200 ng/μl）、C3（100 ng/μl）和C4（50 ng/μl）分装于 RNase free 冻存管中并编号，–80 ℃冰箱保存，每组 3 个重复样本。将 RNA样本每天冻融2 次，上下午各一次，待 RNA 完全融化后放回–80 ℃ 保存，重复此操作，样本共计冻融 5 次（N5）、10 次（N10）、15 次（N15）及 20 次（N20），并在 2 周内行 RNA 浓度及纯度检测。

1.2.3 RNA 浓度和纯度检测 取 2 μl RNA样本，使用核酸蛋白检测仪 NanoDrop 检测 RNA 浓度及OD260/OD280比值。比值在 1.8～2.1 范围内，表明 RNA 纯度较好；比值 <1.8 表明有 DNA、蛋白质污染；比值 >2.1 表明 RNA降解或有异硫氰酸胍等物质污染。

1.3 统计学处理

应用 SPSS 19.0 统计软件对实验数据进行分析，计量资料以±s表示，各组间差异比较采用单因素方差分析，设定P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度 RNA 在 4 ℃ 放置不同时间对 RNA 质量的影响

使用 NanoDrop 分光光度计检测 RNA 的浓度和纯度。结果如表 1所示，不同浓度 RNA 在 4 ℃ 放置不同时间 RNA 浓度范围：C1（400 ng/μl：399.0～436.4 ng/μl）；C2（200 ng/μl：205.5～215.1 ng/μl）、C3（100 ng/μl：101.5～106.8 ng/μl）和 C4（50 ng/μl：48.6～53.1 ng/μl）。随着放置时间的延长，不同浓度的 RNA样本在 24 h 时均出现下降趋势，48 h 时均出现上升趋势，72 h 后低浓度的 RNA（50 ng/μl）出现下降趋势，但各时间组并无统计学差异（P>0.05）；不同浓度 RNA 4 ℃ 放置不同时间 RNA 纯度OD260/OD280比值范围：C1（400 ng/μl：2.03～2.05）；C2（200 ng/μl：2.02～2.04）、C3（100 ng/μl：2.00～2.02）和C4（50 ng/μl：1.99～2.05），各组标准差在 ±0.01～±0.58 之间，且无统计学差异（P>0.05）。以上结果表明，组织样本RNA 在 4 ℃ 条件下放置，不同浓度的 RNA样本其浓度整体呈先下降后上升的趋势，RNA 纯度基本保持不变。

表1 不同浓度 RNA样本在 4 ℃ 放置不同时间对 RNA 浓度和纯度的影响（±s）

表1 不同浓度 RNA样本在 4 ℃ 放置不同时间对 RNA 浓度和纯度的影响（±s）

C1（400 ng/μl） C2（200 ng/μl） C3（100 ng/μl） C4（50 ng/μl）放置时间（h） 浓度（ng/μl） OD260/OD280 浓度（ng/μl） OD260/OD280浓度（ng/μl） OD260/OD280 浓度（ng/μl） OD260/OD280 0 417.4 ± 7.26 2.04 ± 0.01 209.8 ± 9.36 2.02 ± 0.01103.2 ± 0.46 2.01 ± 0.01 52.8 ± 8.18 1.99 ± 0.03 6 417.2 ± 15.59 2.04 ± 0.01 209.8 ± 9.36 2.02 ± 0.01103.2 ± 0.46 2.01 ± 0.01 51.4 ± 1.69 1.99 ± 0.04 12 407.1 ± 4.91 2.05 ± 0.01 206.0 ± 3.89 2.03 ± 0.02103.0 ± 2.38 2.01 ± 0.03 51.0 ± 1.99 1.99 ± 0.03 24 399.0 ± 6.33 2.04 ± 0.01 207.4 ± 3.42 2.04 ± 0.01102.6 ± 1.78 2.00 ± 0.03 50.5 ± 1.19 1.99 ± 0.03 48 424.2 ± 14.92 2.05 ± 0.01 205.5 ± 0.87 2.03 ± 0.01101.5 ± 1.15 2.01 ± 0.01 53.1 ± 3.16 2.00 ± 0.02 72 426.6 ± 17.21 2.04 ± 0.01 215.1 ± 6.60 2.03 ± 0.01106.4 ± 3.87 2.01 ± 0.00 51.8 ± 2.55 2.01 ± 0.01 96 433.7 ± 15.01 2.03 ± 0.01 211.2 ± 3.48 2.04 ± 0.01105.5 ± 1.44 2.02 ± 0.01 51.3 ± 1.44 2.02 ± 0.01 168 436.4 ± 8.71 2.04 ± 0.02 214.7 ± 4.65 2.03 ± 0.01106.8 ± 1.25 2.01 ± 0.02 48.6 ± 0.51 2.05 ± 0.58

2.2 不同浓度 RNA样本常温放置不同时间对 RNA 浓度和纯度的影响

结果如表 2所示，不同浓度 RNA 常温放置不同时间RNA 浓度范围：C1（400 ng/μl：404.7～417.4 ng/μl）；C2（200 ng/μl：205.7～218.2 ng/μl）、C3（100 ng/μl：102.1～108.5 ng/μl）和 C4（50 ng/μl：49.0～53.6 ng/μl）。随着放置时间的延长，不同浓度的 RNA样本在 6 h 时均出现下降趋势，其他时间浓度呈无规律变化，各时间组也无统计学差异（P>0.05）；不同浓度 RNA 常温放置不同时间纯度OD260/OD280比值范围：C1（400 ng/μl：2.04～2.06）；C2（200 ng/μl：1.98～2.05）、C3（100 ng/μl：1.93～2.03）和 C4（50 ng/μl：1.93～2.05），各组标准差在 ±0.01～±0.04 之间，且无统计学差异（P>0.05）。以上结果表明，组织样本 RNA在常温条件下放置，不同浓度的 RNA样本在 6 h 时均出现下降趋势，其他时间浓度呈无规律变化，RNA 的纯度基本保持不变。

表2 不同浓度 RNA样本常温放置不同时间对 RNA 浓度和纯度的影响（±s）

表2 不同浓度 RNA样本常温放置不同时间对 RNA 浓度和纯度的影响（±s）

C1（400 ng/μl） C2（200 ng/μl） C3（100 ng/μl） C4（50 ng/μl）放置时间（h） 浓度（ng/μl） OD260/OD280 浓度（ng/μl） OD260/OD280浓度（ng/μl） OD260/OD280 浓度（ng/μl） OD260/OD280 0 417.4 ± 7.26 2.04 ± 0.01 209.8 ± 9.36 2.02 ± 0.01103.2 ± 0.46 2.01 ± 0.01 52.8 ± 8.18 1.99 ± 0.03 3 412.4 ± 20.50 2.05 ± 0.00 207.7 ± 2.98 2.04 ± 0.01104.4 ± 2.47 2.01 ± 0.01 51.0 ± 1.08 2.00 ± 0.04 6 404.7 ± 3.15 2.05 ± 0.01 205.7 ± 2.05 2.04 ± 0.01102.1 ± 2.69 2.01 ± 0.02 50.3 ± 1.43 2.01 ± 0.04 12 404.7 ± 5.55 2.06 ± 0.01 207.3 ± 1.31 2.05 ± 0.01104.1 ± 2.21 2.03 ± 0.02 50.8 ± 1.19 2.03 ± 0.02 24 406.3 ± 4.28 2.06 ± 0.01 206.2 ± 3.12 2.05 ± 0.01104.4 ± 1.37 2.03 ± 0.01 50.4 ± 1.71 2.03 ± 0.02 48 409.6 ± 5.55 2.05 ± 0.00 205.7 ± 2.02 2.04 ± 0.02103.5 ± 3.44 2.03 ± 0.01 50.8 ± 0.70 2.02 ± 0.02 72 414.2 ± 5.06 2.05 ± 0.01 207.3 ± 3.97 2.04 ± 0.01105.4 ± 2.55 2.02 ± 0.02 49.9 ± 1.20 2.05 ± 0.03 96 412.4 ± 3.22 2.05 ± 0.00 207.0 ± 2.30 2.04 ± 0.01102.4 ± 1.40 2.01 ± 0.02 49.0 ± 1.20 2.03 ± 0.01 168 411.1 ± 43.73 2.04 ± 0.02 218.2 ± 18.711.98 ± 0.03108.5 ± 2.18 1.93 ± 0.02 53.6 ± 2.44 1.93 ± 0.02

2.3 组织 RNA样本冰上反复冻融对不同浓度 RNA 质量的影响

结果如表 3所示，不同浓度的 RNA样本经反复冻融5、10、15 和 20 次（2 周内）后 RNA 浓度范围：C1（400 ng/μl：377.8～417.4 ng/μl）；C2（200 ng/μl：195.0～209.8 ng/μl）、C3（100 ng/μl：97.0～103.2 ng/μl）和 C4（50 ng/μl：48.0～52.8 ng/µl）。随着冻融次数增多，不同浓度的 RNA样本浓度均出现明显下降趋势，但各组间均无统计学差异（P>0.05）；不同浓度 RNA 经反复冻融 5、10、15 和 20 次（2 周内）后 RNA 纯度OD260/OD280比值范围：C1（400 ng/μl：2.03～2.04）；C2（200 ng/μl：2.02～2.03）、C3（100 ng/μl：1.99～2.01）和 C4（50 ng/μl：1.99～2.00），各组标准差在 ±0.01～±0.03 之间，且无统计学差异（P>0.05）。以上结果表明，保存在–80 ℃ 冰箱中不同浓度的RNA样本，在冰上反复冻融（2 周内）后浓度均有下降，RNA 的纯度基本保持不变。

表3 组织 RNA样本冰上反复冻融对 RNA 浓度和纯度的影响（±s）

表3 组织 RNA样本冰上反复冻融对 RNA 浓度和纯度的影响（±s）

C1（400 ng/μl） C2（200 ng/μl） C3（100 ng/μl） C4（50 ng/μl）冻融次数（n） 浓度（ng/μl） OD260/OD280 浓度（ng/μl） OD260/OD280浓度（ng/μl） OD260/OD280 浓度（ng/μl） OD260/OD280 0 417.4 ± 7.3 2.04 ± 0.01 209.8 ± 9.362.02 ± 0.01103.2 ± 0.5 2.01 ± 0.01 52.8 ± 8.2 1.99 ± 0.03 5 396.2 ± 2.3 2.03 ± 0.01 203.8 ± 1.6 2.03 ± 0.01102.0 ± 4.5 2.00 ± 0.01 49.4 ± 1.1 2.00 ± 0.03 10 395.1 ± 8.4 2.04 ± 0.01 199.0 ± 4.6 2.03 ± 0.01100.3 ± 1.2 2.00 ± 0.01 49.6 ± 1.0 2.00 ± 0.01 15 392.0 ± 4.4 2.04 ± 0.01 197.3 ± 3.0 2.02 ± 0.0197.9 ± 1.9 1.99 ± 0.02 48.0 ± 1.5 1.99 ± 0.02 20 377.8 ± 13.9 2.04 ± 0.01 195.0 ± 6.9 2.02 ± 0.0197.0 ± 2.2 2.00 ± 0.02 48.3 ± 1.8 1.99 ± 0.01

3 讨论

RNA样本的质量检测包括浓度、纯度、完整性以及RT-PCR 反应扩增率等，而完整性和均一性是评价 RNA 质量的两个最关键指标[9-12]。生物分析仪和OD260/OD280的比值是反映 RNA 质量的常用方法和指标。由于 RNA 极其容易降解，影响其质量的因素众多，目前的科学研究中大多都集中在不同标本的保存条件和时间对 RNA 质量的影响，如何松哲等[5]研究的是不同保存和处理方式对全血标本总RNA 提取的影响；李维凯等[13]研究的是保存条件对大鼠海马组织总 RNA 质量的影响；张杰等[6]研究的是乳腺癌细胞在不同温度和不同放置时间对总 RNA 提取浓度和纯度的影响等；然而不同浓度的 RNA 在不同的保存条件下对RNA 的质量影响却少有报道。

杨秀荣等[8]报道过将 RNA样本置于 4 ℃ 条件下，每隔 5 h、10 h、15 h、20 h、25 h、3 d、7 d 和 14 d 对提取的 RNA 进行检测，结果显示 14 d 后 RNA 完整性较好。我们研究同样发现不同浓度的 RNA样本在 4 ℃ 条件下放置 168 h（1 周），RNA 浓度和纯度均与 0 h 没有统计学差异，说明该条件下不会影响 RNA 的浓度和纯度。毛君婷等[7]报道过将 RNA样本置于 4 ℃ 条件下放置 24 h 和48 h，结果显示样本在室温条件下可以保存 24 h 以上，48 h时有少量降解，我们研究发现不同浓度的 RNA样本在常温条件下放置 168 h（1 周），RNA 浓度和纯度均与 0 h 没有统计学差异，说明该条件下不会影响 RNA 的浓度和纯度。因此不同浓度的 RNA样本在 4 ℃ 或常温放置 168 h（1 周）内，虽然 RNA 浓度有降低和升高，但是 RNA 纯度OD260/OD280比值基本保持不变。导致 RNA 纯度改变的原因我们认为是 RNA 不稳定，在存放过程中核酸降解一方面可以影响其浓度，另一方面降解产物可影响 RNA 纯度，最终会影响 RNA 的质量。我们发现以OD260/OD280比值作为评价指标，RNA 在 4 ℃ 或常温条件下放置 1 周RNA 纯度基本不变。即使如此，由于生物分析仪是分析和反映 RNA 质量的另一常用方法和指标，但是我们忽略了该方法对研究结果进一步验证，这是我们研究存在的局限性。

RNA 通常是从组织、全血和培养的细胞中获得[14]，从不同的标本中提取的 RNA 浓度会有所不同，在我们实际的临床检测和科学研究过程中，经常需要对某一样品 RNA 进行重复检测，因此，探讨不同浓度的 RNA 反复冻融对RNA 质量的影响具有现实意义。课题组前期研究发现高浓度的 RNA 冻融 1、11、26 和 41 次，结果显示随着冻融次数的增多，RNA 浓度出现明显的下降趋势，但是各组并没有统计学差异[15]。本次研究我们发现不同浓度的 RNA冻融多次（5、10、15 和 20 次），RNA 浓度均出现明显的下降趋势，但是各组 RNA 浓度和纯度并没有统计学差异，相应的OD260/OD280均在 1.8～2.1 之间，纯度基本保持不变。因此保存在–80 ℃ 冰箱中不同浓度的 RNA 反复冻融后对 RNA 的浓度有一定影响，但对 RNA 的纯度影响不大。

总之，本研究结果显示不同浓度的 RNA样本在 4 ℃或常温条件下放置 1 周，不会对 RNA 浓度和纯度造成明显影响；不同浓度的 RNA 在 2 周内反复冻融会降低RNA 的浓度，但是不会影响 RNA 的纯度。