活性氧与蜡样芽孢杆菌菌膜形成的相关性

夏俊芳，潘 苗，奇那尔，玛格撇尔，古丽娜孜，武 运

（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是一种常见的革兰氏阳性食源性病原体，广泛分布于各种环境中，并形成耐酸、耐热和耐干燥的孢子[1]。该病原菌会引起全身感染和食物中毒，如腹泻、呕吐、脑膜炎、败血症、眼内炎和牙周炎等[2]。Bacillus cereus经常在生鲜乳及加工乳中被发现且可以附着在加工机械的表面，如阀门、管道和泵等，甚至形成菌膜，菌膜中的病原体对机械作用或常用消毒剂具有较强的抵抗力，会带来严重的健康风险，人体大约80%的细菌感染与菌膜有关[3]。在乳品加工线上形成的Bacillus cereus菌膜会增加该菌反复污染的风险，降低乳制品的质量，导致食品腐败从而引起食品安全问题[4]，对乳制品行业造成极大的威胁[5]。如何彻底消除乳品环境中的菌膜已成为一大挑战[6]，为此，了解Bacillus cereus菌膜的形成至关重要，制定合理的方案以消除乳品加工业中Bacillus cereus菌膜的污染问题。

目前，关于Bacillus cereus菌膜形成的研究主要集中在内部因素和外部因素两个方面，内部因素如Sin R[7]、Cod Y[8]、Sigma54（RpoN）[9]基因编码的蛋白质被认为参与Bacillus cereus菌膜的形成，外部因素包括酸碱度、温度、营养成分和细菌特性等[10−11]。CORCIONIVOSCHI等[12]通过对细菌Noxs研究综合分析后（Noxs是可以专一催化产生活性氧（ROS）酶类）提出，Noxs介导产生的ROS可能是细菌的一种重要信号分子，ROS可能参与食源性致病菌菌膜的形成，细菌菌膜形成中通常会伴随ROS的产生，但其对菌膜形成的影响尚无定论，如SHIVAPRASAD等[13]研究发现维生素C通过产生ROS使大肠杆菌（Escherichia coli）EMC17菌株氧化应激抑制其菌膜形成，菌膜基因表达下调；SUO等[14]研究发现超氧化物歧化酶缺失的单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）突变体中ROS生成量升高，菌膜形成能力显著下降；WHITE等[15]研究发现过氧化氢酶（katA）基因破坏的奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）ROS水平增加，菌膜生物量减少，但KULKARNI等[16]发现香烟烟雾（ROS存在）下增加金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌膜的形成；VILLA等[17]指出持续的外源ROS处理增加棕色固氮杆菌（Azotobacter vinelandii）野生型菌株（UW136）菌膜形成。WANG等[18]研究发现Bacillus cereus（ATCC14579）在黄素腺嘌呤二核苷酸刺激下增大Nox2转化率，证实Bacillus cereus中存在Noxs活性，活性部位存在于细胞膜上，因此，ROS与Bacillus cereus菌膜的形成和基因调控相关，但ROS在Bacillus cereus代谢或菌膜形成中的确切作用仍不清楚，且多数研究中的菌株并非来源于食品分离菌株，菌株差异性导致研究结果对实际指导的意义有限。

本文以新疆乌鲁木齐夏秋两季市售原料奶中Bacillus cereus分离株为研究目标，通过外源H2O2、N-乙酰半胱氨酸（NAC）ROS清除剂、二苯基氯化碘（DPI）NADPH氧化酶抑制剂处理Bacillus cereus，探讨ROS与Bacillus cereus菌膜形成之间的关系，为后期食品加工、运输过程中Bacillus cereus菌膜污染的有效控制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus） 菌株N2、N6，菌株Y10、Y22、Y34，菌株L6、L8、L9、L12、L24根据国标（GB4789.14-2014食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验）分别从新疆乌鲁木齐零市售新鲜牛乳、羊乳及驴乳分离筛选，菌株甘油管冻存于−80 ℃冰箱备用。Bacillus cereus（CMCC63303）（BC） 上海理工大学医疗器械与食品学院微生物实验室；营养琼脂培养基、LB肉汤培养基 北京陆桥生物技术有限公司；0.1%结晶紫 分析纯，广东光华科技股份有限公司；NAC（N-乙酰半胱氨酸） 上海源叶生物科技有限公司；碘化丙啶（PI）试剂、二苯基氯化碘盐（DPI） 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴化物（MTT） 贝奥替米生物技术公司（中国上海）；95%乙醇 成都市科隆化学品有限公司；过氧化氢（H2O2）、2.7二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲基亚砜（DMSO） 天津市恒兴化学试剂制造有限公司。

HR40-IIA2生物安全柜 青岛海尔特种电器有限公司；Tu-1810APC分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；LE2002E/02电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；LDZX-50KBS型高压灭菌锅 上海早安医疗器械厂产品；THZ-98AB恒温培养振荡箱、DHP-9082电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；MX-E涡旋振荡器 大龙兴创实验仪器北京有限公司；PHS-3C数显台式酸度计 上海浦春计量仪器有限公司；Tecan多功能酶标仪（Spark） 奥地利Tecan Austria GmbH公司；生物激光共聚焦显微镜（TCS SP8） 德国徕卡公司。

1.2 实验方法

1.2.1 奶源Bacillus cereus菌株的活化培养 将甘油管冻存的Bacillus cereus菌株进行活化，以0.1%接种量分别接入10 mL LB液体培养基，30 ℃、150 r/min条件下培养18 h后，用新鲜LB培养基将菌液稀释至OD600为0.3，于4 ℃冰箱中贮存备用。

1.2.2 细菌活力及细胞活性测定 将OD600为0.3的Bacillus cereus菌液接入96孔细胞培养板每孔100 μL，30 ℃培养24 h后测量细菌浓度（OD600）为细菌活力值，然后向每孔添加20 μL 0.5 mg/mL MTT密封后30 ℃反应4 h离心（4000 r/min，10 min）弃上层液体，再向每孔加150 μL二甲亚砜（DMSO），震荡溶解蓝色结晶，在570 nm波长下测量各孔光密度，以所有菌株细胞活性（MTT）均值绘图。

1.2.3 菌膜测定 采用96孔结晶紫染色法[19]测定菌膜含量，将OD600为0.3的Bacillus cereus菌液接入96孔细胞培养板，每孔100 μL，平行接种5个孔，以相同条件的无菌LB液体培养基作为阴性对照，30 ℃下培养24 h后移除菌液，用无菌蒸馏水洗涤3次，室温静置30 min，然后向每孔中加入100 μL 0.1%结晶紫溶液，染色30 min后弃去结晶紫溶液，用无菌蒸馏水洗涤3次并室温静置干燥，再向每孔加入110 μL 95%乙醇溶液，脱色45 min后用酶标仪测定570 nm波长下吸光值，根据OD570值的大小衡量菌膜的形成量，分别进行3次独立重复试验。按照STEPANOVIC等[20]的菌膜划分标准，以空白对照（空白孔）平均吸光值加上3倍标准差为界定值（ODc），将菌株的菌膜形成能力划分为4个等级：OD570≤ODc，菌膜阴性；ODc

1.2.4 ROS测定 采用DCFH-DA（2，7二氯荧光素二乙酸酯）法进行ROS测量[19]，向形成菌膜的96孔板中加入10 μmol/L的DCFH-DA，30 ℃避光培养30 min后用酶标仪检测每孔的荧光值（激发光波长488 nm，发射光波长530 nm），以所有菌株ROS的均值绘图。

1.2.5 H2O2对Bacillus cereus菌膜形成的影响 将H2O2加入OD600为0.3的Bacillus cereus菌液中，使H2O2终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100 μmol/L，混匀后，分别取100 μL加入96孔细胞培养板中，设5个平行，密封后静置于30 ℃培养箱，24 h培养后按照1.2.2、1.2.3、1.2.4进行细菌活力及细胞活性测定、菌膜测定、ROS测定。

1.2.6 N-乙酰半胱氨酸（NAC）对Bacillus cereus菌膜形成的影响 将NAC加入OD600为0.3的Bacillus cereus菌液中，使NAC终浓度为0、0.0001、0.001、0.01、0.1、1 mmol/L，混匀后，分别取100 μL加入96孔细胞培养板中，设5个平行，密封后静置于30 ℃培养箱，24 h培养后按照1.2.2、1.2.3、1.2.4进行细菌活力及细胞活性测定、菌膜测定、ROS测定。

1.2.7 二苯基氯化碘盐（DPI）对Bacillus cereus菌膜形成的影响 将DPI加入OD600为0.3的Bacillus cereus菌液中，使DPI终浓度为0、0.05、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L，混匀后，分别取100 μL加入96孔细胞培养板中，设5个平行，密封后静置于30 ℃培养箱，24 h后培养后按照1.2.2、1.2.3、1.2.4进行细菌活力及细胞活性测定、菌膜测定、ROS测定。

1.2.8 激光共聚焦显微镜测定菌膜形成 将1 mL OD600为0.3的Bacillus cereus（CMCC63303）菌液接入12孔细胞培养板中作为对照组，分别添加终浓度为0.01、0.1、1、10、100 μmol/L H2O2，终浓度为0.0001、0.001、0.01、0.1、1 mmol/L NAC，终浓度为0.05、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L DPI为处理组，置于30 ℃培养箱，24 h培养后用无菌蒸馏水洗涤3次，室温静置45 min后用碘化丙啶（PI）荧光染液封片，然后用激光共聚焦显微镜观察菌膜形成。

1.3 数据处理

实验重复三次，采用Statistix 8.1（分析软件，St Paul，MN）软件包中Linear Models程序对数据进行统计分析，采用Dun检验进行多重比较确定差异显著性，应用Excel 2016和Adobe illustrator 2020制作图表。

2 结果与分析

2.1 H2O2对Bacillus cereus生长及菌膜形成的影响

由图1可知，随着H2O2浓度的升高，细菌活力逐渐下降，所有H2O2处理组（0.01、0.1、1、10、100 μmol/L）Bacillus cereus活力显著低于对照组细菌活力（P<0.05）。由图1细胞活性变化趋势可知，当H2O2浓度≥1 μmol/L时，Bacillus cereus细胞活性显著高于H2O2低浓度处理组（0.01、0.1 μmol/L）细胞活性（P<0.05），表明较高浓度的H2O2对细胞活性有一定的促进作用。

图1 不同H2O2浓度对蜡样芽孢杆菌活力和细胞活性的影响Fig.1 Effect of different H2O2 concentration on vigor and viability of Bacillus cereus

由图2可知，0.01、1、100 μmol/L H2O2处理组平均菌膜形成量均高于对照组平均水平（P<0.05）。0.01 μmol/L H2O2处理时，Y10、Y22、Y34菌株形成较强菌膜，BC、N6、L9、L12、L24菌株形成中等菌膜，N2、L6、L8菌株形成较弱菌膜；1 μmol/L H2O2处理时，BC、N2、N6、Y10、L24菌株形成较强菌膜，Y22、Y34、L6、L9、L12菌株形成中等菌膜，L8菌株形成较弱菌膜；100 μmol/L H2O2处理时，BC、N2、N6、Y10、Y22、Y34、L8、L12、L24菌株形成较强菌膜，L6、L9形成中等菌膜。

由图2可知，0.1、10 μmol/L H2O2处理组平均菌膜形成量与对照组平均菌膜水平无显著性差异（P>0.05）。0.1 μmol/L H2O2处理时，BC、N6、Y10、Y22、Y34、L12、L24菌株形成中等菌膜，N2、L6、L8、L9形成较弱菌膜；10 μmol/L H2O2处理时，BC、Y10、Y22、Y34、L24菌株形成中等菌膜，N2、N6、L6、L8、L9、L12菌株形成较弱菌膜；对照组N2、N6、Y10、L9、L12菌株形成中等菌膜，BC、Y22、Y34、L6、L8、L24菌株均形成较弱菌膜。可见部分浓度H2O2处理促进Bacillus cereus菌膜形成。

图2 不同H2O2浓度对蜡样芽孢杆菌ROS产生及菌膜形成的影响Fig.2 Effect of different H2O2 concentration on ROS production and biofilms formation of Bacillus cereus

由图2 ROS变化趋势可知，随着H2O2浓度的升高，ROS逐渐下降。尽管外源补充H2O2但ROS水平并未提高，这可能是因为Bacillus cereus对这种外源氧化压力作出应答且菌体本身也在不断产生和消耗ROS，因此，即使外源补充100 μmol/L H2O2，ROS含量仍呈下降趋势。这与REDER等[21]的研究发现一致，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌膜相关基因突变株经百草枯和H2O2等超氧化物生成剂处理后ROS含量显著减少（P<0.05）。结果表明：伴随着ROS含量的降低，Bacillus cereus菌膜形成量增强，因此，Bacillus cereus菌膜形成与ROS的减少相关。

2.2 NAC对Bacillus cereus生长及菌膜形成的影响

由图3可知，与对照组相比，NAC各处理组Bacillus cereus活力显著低于对照组细菌活力（P<0.05），各处理组间细菌活力无显著差异（P>0.05）。NAC 各处理组细胞活性与对照组相比无显著性差异（P>0.05），表明NAC处理浓度对Bacillus cereus的生长和细胞活性的影响不大。这与GUO等[22]研究发现NAC处理组浓度对单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的生长和生存能力没有影响的结果一致。

图3 不同NAC浓度对蜡样芽孢杆菌活力和细胞活力的影响Fig.3 Effect of different NAC concentration on vigor and viability of Bacillus cereus

由图4可知，NAC各处理组平均菌膜形成量均显著高于对照组平均菌膜形成量（P<0.05）。各处理组间相比，0.0001 mmol/L NAC处理组及

0.001 mmol/L NAC处理组平均菌膜形成量最高，0.01 mmol/L NAC处理组平均菌膜形成量最低。

当0.0001 mmol/L NAC处理时，Y22、Y34菌株形成较强菌膜；0.001 mmol/L NAC处理时，N6、Y22、L12菌株形成较强菌膜；0.1 mmol/L NAC处理时，Y22菌株形成较强菌膜；1 mmol/L NAC处理时，Y10菌株形成较强菌膜；0.01 mmol/L NAC处理时，L9、L24菌株形成较弱菌膜，其他9株菌均形成中等菌膜；对照组N2、N6、Y10、L9、L12菌株形成中等菌膜，BC、Y22、Y34、L6、L8、L24菌株均形成较弱菌膜。

由图4 可知，随NAC浓度的升高，ROS逐渐下降。这是因为NAC是ROS的清除剂，随着NAC浓度的增大，ROS含量逐渐减小，但Bacillus cereus菌膜形成量增大。这与GUERINI等[23]研究发现铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌膜随NAC浓度（0.5～4.0 mg/mL）增加而增加的结果一致。结果表明，Bacillus cereus菌膜形成与ROS的减少相关。

图4 不同NAC浓度对蜡样芽孢杆菌ROS产生及菌膜形成的影响Fig.4 Effect of different NAC concentration on ROS production and biofilms formation of Bacillus cereus

2.3 DPI对Bacillus cereus生长及菌膜形成的影响

由图5可知，随着DPI浓度的升高，细菌活力逐渐下降，所有DPI处理组（0.05、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L）Bacillus cereus活力显著低于对照组细菌活力（P<0.05）。由图5细胞活性变化趋势知，随着DPI浓度的升高，细胞活性也逐渐减弱，当DPI浓度大于1 μmol/L时，Bacillus cereus细胞活性显著低于对照组（P<0.05）但仍有细胞活性。

图5 不同DPI浓度对蜡样芽孢杆菌活力和细胞活力的影响Fig.5 Effect of different DPI concentration on vigor and viability of Bacillus cereus

由图6可知，当DPI浓度≤1 μmol/L时，随着DPI浓度的升高，平均菌膜形成量均高于对照组平均菌膜水平（P<0.05）。其中，0.1 μmol/L DPI处理组及1 μmol/L DPI处理组平均菌膜形成量最高，显著高于0.05 μmol/L DPI处理组及0.5 μmol/L DPI平均菌膜形成量（P<0.05）。0.1 μmol/L DPI处理时，N6、L9、L12菌株形成较强菌膜；1 μmol/L DPI处理时，N6菌株形成较强菌膜，其他菌株均形成中等菌膜；0.05 μmol/L DPI处理时，Y34菌株形成较弱菌膜，其他菌株均形成中等菌膜；0.5 μmol/L DPI处理时，BC、Y34、L24菌株形成较弱菌膜，其他菌株均形成中等菌膜。

当DPI浓度>5 μmol/L 时，随着DPI浓度的升高，平均菌膜形成量低于对照组平均菌膜水平（P<0.05）。5 μmol/L DPI处理组平均菌膜形成量显著高于10 μmol/L DPI处理组平均菌膜形成量（P<0.05）。5 μmol/L DPI处理时， N6、Y10、L9、L12菌株形成中等菌膜，其他菌株均形成较弱菌膜；10 μmol/L DPI处理时，N6、L9、L12菌株形成中等菌膜，其他菌株均形成较弱菌膜；对照组N2、N6、Y10、L9、L12菌株形成中等菌膜，其他菌株BC、Y22、Y34、L6、L8、L24形成较弱菌膜。

由图6 ROS变化趋势可知，随着DPI浓度的升高，ROS的产生水平呈U型趋势。这是因为DPI是一种NADPH氧化酶抑制剂，抑制ROS产生，当DPI浓度≤1 μmol/L时，随着DPI浓度的升高，ROS逐渐下降；当DPI浓度>5 μmol/L时，随着DPI浓度的升高，ROS含量升高。结果表明：ROS产生和菌膜形成的趋势相反，即低浓度DPI处理伴随ROS的降低，Bacillus cereus菌膜形成量的增加，高浓度DPI处理伴随ROS含量的升高，Bacillus cereus菌膜形成量的减少，因此，Bacillus cereus菌膜形成与ROS的减少相关。

图6 不同DPI浓度对蜡样芽孢杆菌ROS产生及菌膜形成的影响Fig.6 Effect of different DPI concentration on ROS production and biofilms formation of Bacillus cereus

2.4 激光共聚焦显微镜测定菌膜形成

由图7A可知，0.01 μmol/L H2O2、1 μmol/L H2O2、100 μmol/L H2O2处理组与对照组相比具有更强的染色效果，菌膜呈现红色的网络结构，而未经处理组（对照组）呈现松散的结构和更少的菌膜生物量，与图2定量菌膜形成结果一致。由图7B可知，NAC各处理组与对照组相比具有更强的染色，各处理组菌膜呈现红色的网络结构，而对照组显示松散的结构和较少的菌膜生物量，与图4定量菌膜形成结果一致。由图7C可知，低浓度各处理组（DPI≤1 μmol/L）与对照相比具有更亮的染色，呈现红色的网络结构，高浓度处理组（DPI>5 μmol/L）随着DPI浓度的升高，红色信号越来越弱，当10 μmol/L DPI浓度处理时，视野中红色信号极少，表明低浓度的DPI处理对Bacillus cereus菌膜形成起促进作用，高浓度DPI处理对Bacillus cereus菌膜形成起抑制作用，与图6定量菌膜形成结果一致。因此，综合以上结果，本研究得到Bacillus cereus菌膜形成与ROS减少相关的结论，这与HAJ等[24]发现金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌膜的形成依赖于ROS诱导量减少有关的研究结果一致。

图7 共聚焦显微镜下观察不同浓度（H2O2、NAC、DPI）对蜡样芽孢杆菌菌膜形成的影响Fig.7 Effect of different concentrations (H2O2, NAC, DPI) on the formation of Bacillus cereus biofilms observedunder confocal microscope

3 结论与讨论

ROS包括羟基自由基（OH）、原子氧（O）、过氧化氢（H2O2）、单线态氧（1O2）和臭氧（O3）等，ROS的累积超过允许水平会对各种大分子（DNA、蛋白质和脂质）造成损害，最终导致细胞死亡[25]，ROS在生物体中的作用不是单一的、绝对的，细菌往往会通过某些途径主动生成较低水平的ROS，这些ROS在细菌中起到信号或是调节的作用，激发细菌某些特殊机制，如进入防御状态、辅助细菌入侵宿主细胞、抑制环境中其他竞争者等[26]。CAP等[27]研究发现一定水平的ROS诱导会保护机体免受压力机制，引起菌体对压力适应性反应，ROS可能是作为诱导细菌群落分化和信号传递的信号分子，ROS诱导遗传变异促进特定菌膜区域的细胞死亡，以部分细胞的死亡增加同一群体中其他细胞的存活。

因此，ROS作为一种信号分子，探究其在细菌及其菌膜形成中的具体作用，有利于研发新型高效的抑菌剂和杀菌剂。本研究从不同奶源Bacillus cereus分离株的菌膜形成分析入手，以一定浓度的H2O2、NAC、DPI处理待测菌株，采用96孔结晶紫定量测定及激光共聚焦显微镜观察菌膜形成情况，实验中测试了细菌细胞活力，以排除试剂对细菌活性的影响，发现ROS是Bacillus cereus菌膜形成的潜在信号分子，随着ROS的减少，Bacillus cereus菌膜形成量增加。在未来的研究中，还需进一步剖析外源ROS和内源ROS在调节菌膜形成中是否发挥不同的作用，并检测可疑NADPH氧化酶的敲除和过表达是否改变Bacillus cereus的ROS产生和菌膜形成，这将有助于理解Bacillus cereus与ROS相关的菌膜形成机制。