RNA结合基序蛋白25作用的研究进展

赵可心，丁 虹，刘 述，张小卫

(兰州大学第二医院，甘肃 兰州 730000)

RNA结合蛋白(RNA binding proteins，RBPs)通常被认为是通过一个或多个球状RNA结合域(RNA-binding domain)结合RNA并改变结合RNA结构或功能的蛋白质。RBPs在RNA加工和代谢中起着至关重要的作用，包括mRNA前体剪接，聚腺苷酸化，mRNA定位、转运和翻译，mRNA稳定性控制和各种类型RNA的编辑[1]。这些年来，已经发现并研究了数百种类似的RBPs。RBM25则属于RBPs家族的一员，是一种新型的全局性剪接因子。已有大量研究表明RBM25与多种疾病相关，包括心血管疾病与肿瘤，但关于RBM25的系统研究并不多。本文将主要对RNA结合基序蛋白25的基本结构和功能、调控作用机制与研究进展进行综述。

1 RBM25的基本结构与功能

1.1 RBM25的基本结构RBM25在真核生物细胞谱系中的表达广泛且较为保守，它含有843个氨基酸，由3个蛋白质结构域组成：①与RNA结合的N末端有一个富含脯氨酸的结构域(P)和RNA识别基序(RNA recognition motif，RRM)结构域，②富含精氨酸和谷氨酰胺/精氨酸和天门冬酰胺二肽重复序列构(rich in arginine and glutamine/arginine and asparagine dipeptide repeats，RE/RD-rich)的中央结构域，③与RNA结合的C末端的脯氨酸-色氨酸-异亮氨酸结构域(the proline-tryptophan-isoleucine domain，PWI)结构域[2]。

RBPs成员拥有共同的RD/RE-rich结构域及PWI结构域。RD/RE-rich结构域有利于将RBM25定位于富含剪接因子的核小体周围，并与剪接因子如SRm160/300、UsnRNAs相互作用组装剪接体复合物并调控剪接[2]；而且，这种富含RD/RE的基序对于构建和选择性剪接所需的蛋白质-蛋白质相互作用的形成是非常重要的[3]。晶体结构解析显示，PWI结构域的结构主要是由一个高度保守的四股螺旋束组成，它是一类具有结合DNA和RNA 双重能力的新型核酸结合结构域，对单链和双链的核酸均具有相似的亲和力[4]。

1.2 RBM25的功能选择性剪接是基因表达的普遍调节机制，其允许从单个基因产生一个以上的独特mRNA种类，从而产生许多蛋白质异构体，通常具有不同的生物功能。

RBM25是公认的在整个真核细胞系中都高度保守的剪接因子[4]。高通量测序显示，RBM25促进了整个人类基因组中至少20%的选择性剪接[5]。同时，人们对剪接事件的转录组范围分析表明，RBM25不仅调节了整个人类基因组中大部分外显子的剪接，它还通过充当pre-mRNA剪接的调节剂来影响总体转录水平，从而影响更为广泛的基因表达程序，进而影响细胞代谢中涉及的途径。而且，RBM25 还可以作为剪接因子通过与剪接过程中外显子识别相关的因子相互作用，即RBM25与富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子2(serine and arginine rich splicing factor 2，SRSF2)的RS区域特异结合能够促进选择性弱持续外显子的剪接保留。此外，对蛋白质组学分析表明，RBM25通过其各个蛋白质结构域与剪接体的核心元件以及替代剪接调节剂相互作用[5]。以上这些结果均说明RBM25是一个全方位性的可变剪接因子。

2 RBM25的调控作用机制

2.1 RBM25与snRNP和LUC7L3RBM25是一个调控Pre-mRNA剪接的剪接因子，mRNA前体的剪接发生在剪接体中，该剪接体通过添加小核糖核核蛋白(small nuclear ribonucleoproteins，snRNP)颗粒和许多辅助的非snRNP剪接因子进行逐步组装，而内含子的切除和外显子的结合取决于剪接机制对5′剪接位点(5′ss)和3′剪接位点(3′ss)的识别和使用[6]。在mRNA前体剪接的早期，内含子的5′ss序列被核小RNA(small nuclear RNA，snRNA)及其相关蛋白结合，形成U1 snRNP[7]；想要形成一个完整组装的剪接体，U1 snRNA碱基配对识别5′ss并被U1 snRNP稳定是这个过程中至关重要的一环。

Fig 1 Schematic diagram of RNA-binding motif protein 25P:The N-terminal bound to RNA has a proline-rich domain;RRM:RNA recognition motif domain;RE/RD-rich:rich in arginine and glutamine/arginine and asparagine dipeptide repeats;PWI:the proline-tryptophan-isoleucine domain binding to the C-terminal of RNA.

LUC7L3(LUC7 like 3 pre-mRNA splicing factor)被称为对酸中毒和缺氧敏感的剪接因子，是酵母U1 snRNP的相关因子。LUC7L3具有两个锌指结构：第一个锌指结构交联pre-mRNA，是LUC7L3剪接活性所必需的；LUC7L3可通过其第二个锌指结构充当pre-mRNA和U1 snRNP之间的桥梁。RBM25与LUC7L3的人类同源物选择性相关，并且RBM25的作用是由LUC7L3介导的，RBM25选择性地与LUC7L3结合，并通过与外显子剪接顺式元件CGGGCA的相互作用稳定Pre-mRNA-U1 snRNP，从而激活5′ss，最终完成剪接过程[8]。

2.2 RBM25与SCN5ASCN5A是编码心脏钠通道(Nav1.5)的α亚基，该亚基负责产生激发在心肌细胞中传播正常的内向钠电流(INa)功能[9]。扫描整个SCN5A mRNA序列显示：在检测到SCN5A剪接变异体的地方，只有一个RBM25的单一结合位点；并且发现剪接因子RBM25的顺式元件CGGGCA在SCN5A变体E28C和E28D的剪接位点附近。通过凝胶迁移率迁移分析表明：RMB25与SCN5A第28外显子的规范序列CGGGCA特异性结合，导致SCN5A mRNA异常剪接，产生E28C和E28D两个截短的转录物变体，从而激活了UPR(未折叠蛋白反应)，并且这种激活进一步降低了SCN5A的全长mRNA转录丰度，全长SCN5A mRNA和蛋白质减少，从而导致Na+电流减少。证实了剪接调节因子RMB25的上调与下调是引起SCN5A mRNA异常剪接的必要条件[10]。

2.3 RBM25与Bcl-2众所周知，程序性细胞死亡(称为凋亡)在发育和疾病的细胞稳态中发挥至关重要的作用。B淋巴细胞瘤(B-cell lymphoma，Bcl)蛋白可以是促凋亡的，也可以是抗凋亡的，这具体取决于Bcl-2同源性(BCL-2 homology，BH)结构域的存在[11]。Bcl-2家族成员Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bcl-x)是具有多个BH结构域的一种线粒体跨膜蛋白，它可以调节线粒体外膜通透性并响应于不同的刺激后将细胞色素C释放到细胞质中，具有调节内在凋亡通路的功能[12]。Bcl-x基因由3个外显子组成，其中，Bcl-x外显子2的可变剪接事件产生了两种拮抗细胞存活的Bcl-x亚型：抗凋亡的长亚型(Bcl-xL)和促凋亡的短亚型(Bcl-xS)，有多种剪接因子和信号通路会影响Bcl-xL /Bcl-xS剪接比，包括富含丝氨酸/精氨酸的蛋白质，异质核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，hnRNPs)，转录因子和细胞因子[13]。

有研究表明，RBM25表达增加与细胞凋亡增加相关。RBM25通过与位于外显子2内的CGGGCA序列与Bcl-x RNA特异性结合，并以剂量依赖的方式促进促凋亡Bcl-xS 5′ss的选择能力，导致Bcl-xS与Bcl-xL的比率增加，最终促进细胞发生凋亡[11]。

2.4 RBM25与p53和circAMOTL1L-miR-193a-5p-Pcdha通路p53蛋白(protein p53,p53)，环状RNA(circular RNA，circRNA)和微小RNA(micro RNA，miRNA)是激活癌症转移中上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)程序的调控网络的重要组成部分。研究显示，人类前列腺癌(prostatic cancer，PCa)中类血管动蛋白1(angiomotin like 1，Amotl1)衍生的circRNA被称为circAMOTL1L，而circAMOTL1L的降低通过下调E-钙黏着蛋白和上调波形蛋白促进PCa细胞的迁移和侵袭，从而导致EMT和PCa的发展，而circAMOTL1L充当海绵结合PCa细胞中的miR-193a-5p，从而减轻了对Pcdha的miR-193a-5p的抑制基因簇(钙粘蛋白超家族成员的子集)，因此由circAMOTL1L下调介导的circAMOTL1L-miR-193a-5p-Pcdha调节途径的失调有助于体内PCa的生长。此外，该研究表明RBM25能够直接绑定到circAMOTL1L并诱导其生物发生，而p53则通过RBM25基因的直接激活来调节EMT[14]。

3 RBM25在心血管疾病中的研究进展

3.1 RBM25与心力衰竭心血管疾病(cardiovascular diseases，CVDs)发病率高,治愈率低,死亡率大,现已成为严重威胁人类健康疾病[15]。心力衰竭(heart failure，HF)是心血管疾病中一种常见的、进展性的、复杂的临床综合征，是一个严重的公共卫生问题，并且是全球范围内死亡的主要原因，给社会和个人带来了极大的健康威胁和经济负担。然而，导致HF发病率和死亡率高的主要原因之一是与之相关的心律失常[16]。

电压门控钠通道负责可兴奋细胞(如神经元、肌肉和肌细胞)中动作电位的起始和传播。心脏钠离子通道通过响应膜去极化而迅速激活，并通过膜向内传导钠离子，从而产生心脏动作电位的上升,动作电位上升的速率依赖于电压门控钠通道的快速激活，控制着动作电位通过心脏组织传播的速率和均匀性[17]。电压门控NaV1.5是心肌细胞表达的主要钠通道，突变或病理生理条件导致的NaV1.5功能障碍会导致危及生命的心律失常[18]。SCN5A编码的钠通道的活性决定了心脏的去极化和电传导，而编码传导Na+电流(INa+)的离子通道的SCN5A基因突变可能导致心律失常[9]。SCN5A的遗传变异与许多遗传性心脏通道疾病有关，包括Brugada综合征(BrS)、长QT综合征(LQT3)和心脏传导系统功能障碍[9]。在一个小鼠模型中，SCN5A基因的一个等位基因被截断变异体所取代导致胚胎致死，显示心脏Na+电流减少大于80%，胞胚胎干细胞来源的心肌细胞传导速度显著降低[12]，这表明SCN5A即使是细微的变化也可能导致心脏病的发生。

选择性剪接在心脏代偿性反应中起主要作用,剪接因子序列的改变或突变引起基因产物的错误剪接,是导致多种人类疾病的根本原因[19]。有文献表明，剪接因子RBM25的顺式元件CGGGCA在SCN5A变体E28C和E28D的剪接位点附近，并通过qRT-PCR在人HF组织中证实了剪接因子RBM25和LUC7L3的上调。与正常人心脏组织相比，在心衰组织中RBM25和LUC7L3表达分别增高了1.1和0.6倍，而全长SCN5A的mRNA和蛋白的表达降低了0.6倍。为了进一步探索RBM25调控可变剪接的内在机制，该研究小组发现：AngⅡ(血管紧张素2)和缺氧是HF常见的上游信号，可导致LUC7L3和RBM25增加，进而导致RBM25与SCN5A mRNA的结合增加，SCN5A mRNA发生异常剪接，SCN5A剪接变异体增加，产生两个转录物变异体(E28C和E28D)，这两个变异体编码在结构域Ⅳ成孔段之前被截断的心脏Na+通道，从而激活了UPR，并且这种激活进一步降低了全长SCN5A的mRNA转录丰度，全长SCN5A mRNA和蛋白质减少，从而导致Na+电流减少[10]。

总而言之，HF与Pre-mRNA剪接因子的失调有关，其中剪接因子RBM25/LUC7L3复合物介导异常SCN5A mRNA的调控，进而导致变异的钠通道不能发挥正常的生理作用，从而导致电流减少引起心律失常，最终引发HF。

3.2 RBM25与心肌病心肌病是异质性的心肌病变，表现为心肌结构和功能的异常，心肌病最终会导致HF甚至死亡。导致持续性室性快速心律失常的肥厚型心肌病(HCM)是年轻患者猝死的最常见原因[16]。有研究者测试了肥厚型心肌病(HCM)中SCN5A的转录后调控，结果发现：① HCM中的剪接因子RBM25和Luc7A被上调；② HCM中心脏Na+通道SCN5A pre-mRNA存在异常剪接，变异体E28C和E28D的表达水平显着增加；③ HCM中的UPR(未折叠蛋白反应)成分PERK(蛋白激酶RNA样内质网激酶)被上调。这表明了人类HCM钠通道全长mRNA的减少部分是由于异常的SCN5A mRNA剪接和UPR的激活所致，而SCN5A的减少可能会导致HCM患者的心律失常风险[20]。与此同时，剪接调节因子RMB25的上调与下调又是引起SCN5A mRNA异常剪接的必要条件。

4 RBM25在肿瘤中的研究进展

4.1 RBM25与结肠直癌结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是威胁人们生命健康的主要癌症之一，造成了严重的社会负担。预计到2030年，全球CRC的负担将增加60%，达到220万新发病例和110万死亡病例[21]。左侧和右侧结肠癌(LC、RC)的分子特征和预后差异很大，因此需要使用不同的策略进行治疗。有研究小组分析了DESF(差异表达的剪接因子)与DEAS(差异表达的可变剪接)之间的相关性，并对显著相关的区域构建了一个相关网络。结果发现RBM25是相关网络中的枢纽SF(剪接因子)，并且与218个DEAS中的121个显着相关，这表明了RBM25是LC和RC中不同可变剪接事件的关键决定因素。接着，该研究小组又分析了RBM25在结肠癌中的临床意义，发现结肠癌组织中RBM25的表达明显高于邻近组织。但是，生存分析表明，RBM25高表达和低表达的患者的总生存率无明显差异[22]。

随后有研究小组通过蛋白质组分析揭示了RBM25是结直肠癌的肿瘤生物标志物[23]。

4.2 RBM25与前列腺癌PCa是全世界男性中最常见的癌症之一。PCa转移与EMT过程密切相关，这一过程可使上皮细胞丧失粘附相邻细胞和细胞外基质蛋白并获得间质表型的能力[24]。p53、cirRNA和miRNA是激活癌症转移中EMT程序的调控网络的重要组成部分。有研究显示，人类PCa中Amotl1衍生的circAMOTL1L被下调，而降低的circAMOTL1L通过下调E-钙黏着蛋白和增加波形蛋白表达促进PCa细胞迁移和侵袭，从而导致EMT和PCa进程。在这个进程中RBM25负责直接与circAMOTL1L结合并诱导其生物发生，而p53则通过RBM25介导circAMOTL1L来调节EMT相关基因的表达[14]。

4.3 RBM25与急性髓细胞性白血病急性髓细胞性白血病(acute myeloic leukemia，AML)是一种侵袭性血液病，AML构成了一种发展停滞状态，其中类似于正常髓系祖细胞的白血病母细胞无法分化，因此在骨髓和周围器官中积累。最近的癌症基因组测序研究揭示了包括AML在内的许多癌症的遗传学，发现除了编码表观遗传调控因子、转录因子和生长调控因子的基因外，剪接因子基因经常在人AML中发生突变[25]。

最近有研究小组为寻找AML中潜在的剪接调节剂中的新型肿瘤抑制因子和致癌基因做了一系列相关实验。结果发现：RBM25作为潜在的肿瘤抑制因子，它的损失不仅导致大量白血病细胞而且使具有白血病干细胞器特性的细胞的凋亡减少以及增殖增加，最终促进了白血病的发生。从分子上讲，RBM25控制许多关键的Pre-mRNA的剪接，包括编码凋亡调节因子BCL-X和癌基因MYC抑制剂BIN1。RBM25通过抑制BIN1(+12)亚型的表达来限制癌基因MYC活性，从而控制癌基因MYC转录活性,最终起到抑癌的作用[26]。

5 讨论与展望

综上所述，RBM25作为一个新型全方位性剪切因子，对mRNA剪接体的可变剪接和组装的调控过程起着重要作用。RBM25参与细胞凋亡、离子通道电流、细胞因子活性改变过程中关键基因的剪接，与心血管疾病与肿瘤的发生与发展密切相关。RBM25在心力衰竭、心肌病和不同种类癌症中表达升高，提示RBM25可能是临床诊断中潜在的生物标志物。

在HF中，充血性HF为最终的结局，其特征为心肌细胞凋亡、炎症和瘢痕形成，最终导致心肌收缩力丧失，而心肌细胞凋亡在其中起着关键的作用。这表明，心肌细胞凋亡可能是HF发生的直接原因。已有文献表明：在心衰组织中发现RBM25高表达；同时也有文献表明：RBM25通过调节HeLa细胞中的BCL-X亚型的比例来促进细胞发生凋亡。然而，并未有研究阐明RBM25在HF发生与发展过程是否对心肌细胞凋亡产生影响。所以探寻RBM25介导的Pre-mRNA可变剪接在心力衰竭中引起心肌细胞凋亡的分子机制,将为临床治疗HF患者提供有效治疗的靶点。

RBM25在不同种类癌症中表达升高，在体外和体内继续研究 RBM25在致癌或抑癌中的更多调控机制十分重要。RBM25作为一种生物信号，不断深入研究其参与的信号通路与转导途径，有利于提高医疗水平的精准化。