鸦胆子苦醇通过RhoA/ROCK1信号通路抑制人结直肠癌细胞HCT-116的侵袭和迁移

卢睿瑾，杜玉梅，黄世莹，唐加峰,3，张 滔,3，，何 爽，徐 航,，陈地龙,3，冉建华，李 静

(重庆医科大学 1.基础医学院组织学与胚胎学教研室、2.公共卫生与管理学院，重庆 400016；3.重庆三峡医药高等专科学校，重庆 404120；4.重庆医科大学基础医学院解剖学教研室，重庆 400016)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的消化道恶性肿瘤，每年导致近70万人死亡，是世界上第四大致命癌症。在过去的十年里，随着结直肠癌的发病率逐年升高，虽然很多新兴化疗药物的使用延长了晚期结直肠癌患者的平均存活时间，但患者通常在3年内死亡[1]。目前，结直肠癌的治疗方式主要是以手术为主的综合治疗，但术后的复发和转移仍是结直肠癌患者死亡的主要原因。在转移性结直肠癌的治疗方面，西妥昔单抗和伊立替康等常用药物取得了较好的临床疗效，但容易发生耐药[2]。不良的治疗结果提示需要更好地理解导致结直肠癌的发生、发展、转移和扩散的机制。

中药鸦胆子为苦木科植物鸦胆子的干燥成熟果实，始载于《本草纲目拾遗》，又名老鸦胆、苦参子等。性寒味苦，具有清热解毒、抗肿瘤，抗疟疾等作用[3]。鸦胆子苦醇(brusatol，BRU)是一种从鸦胆子油中提取的重要化合物，同时具有多种生物学效应，包括抑制肿瘤细胞生长、减少疟疾对位点的复制、减轻炎症和抵抗病毒入侵等[4]。目前已有研究报道中药鸦胆子苦醇对肝癌[5]、胰腺癌[6]和鼻咽癌[7]等多种肿瘤有抑制作用。但对结直肠癌的研究报道甚少，且作用机制尚不明确。所以本研究拟探讨鸦胆子苦醇对结直肠癌细胞迁移和侵袭的影响和可能的作用机制，以期为结直肠癌的治疗靶点和新药的开发提供理论依据。

1 材料

1.1 细胞株HCT-116结直肠癌细胞由课题组实验平台提供。

1.2 药物与试剂鸦胆子苦醇由三峡医药高等专科学校馈赠。高糖培养基DMEM购自美国Hyclone公司，南美胎牛血清(10270-106,Gibco)购自美国赛默飞公司，二甲基亚砜(DMSO)、RIPA裂解液强(P0013B)、青-链霉素(C0222)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0010S)和蛋白酶磷酸酶抑制剂(P1048)均购自上海碧云天生物技术有限公司，PAGE凝胶快速制备试剂盒和无蛋白快速封闭液均购自上海雅酶生物医药科技有限公司。一抗抗体MMP2(40994S)、MMP9(13667S)购自美国CST公司，RhoA(AF2179)、ROCK1(AF1795)和ROCK抑制剂(Y37632)购自上海碧云天生物科技有限公司，二抗抗体购自美国CST公司。Cell Counting Kit-8(CCK-8,HY-K0301)购自MCE公司。Transwell小室(孔径8.0 μm)和Matrigel胶(356234)均购于Corning公司。

1.3 仪器恒温孵箱(Thermo)；高速台式离心机；低温高速离心机(平凡仪器，TGL-185)；M450酶标测定仪、凝胶成像系统、Western blot电泳仪、电转仪(美国Bio-Rad公司)；DMi8倒置荧光显微镜(德国Leica公司)。

2 方法

2.1 细胞培养HCT-116细胞复苏后，在DMEM培养基(含10%胎牛血清)中培养。将细胞置于37 ℃、5% CO2的孵箱中，每48-72 h传代1次。

2.2 CCK-8法检测细胞增殖取对数期生长的HCT-116细胞，调整细胞数为5×103/孔，平铺于96孔细胞培养板中，每孔加入100 μL培养基。将实验分为3组，每组3个复孔。空白对照组：不接种细胞，不加入BRU，仅含有DMEM完全培养基；对照组：仅接种细胞和DMEM完全培养基，不加入BRU；实验组：接种的细胞加入含终浓度为2.5、5、10、20、40、80、160、320 nmol·L-1BRU的DMEM完全培养基。分别培养24、48、72 h后，将10 μL CCK-8的工作液分别加入每孔中，置于37 ℃孵育2 h。在450 nm处测定其吸光度值(A)。计算24、48、72 h细胞生长抑制率，抑制率%=(A对照组-A实验组)/(A对照组-A空白对照组)×100%，实验重复3次。

2.3 划痕实验用胰酶消化处于对数生长期的HCT-116细胞,将细胞计数后，每孔接种5×104个细胞于6孔板中,待细胞长满后,用灭菌的200 μL枪头在细胞单层的中央区域划一道直线划痕，PBS洗涤后，添加含不同终浓度BRU(3、6 nmol·L-1)的无血清DMEM培养液，对照组则加入含等体积的无血清DMEM培养液，每组取一盘细胞在划痕后立即在倒置显微镜下观察、拍照，其余细胞置于5% CO2、37 ℃恒温孵箱中培养24 h，在倒置显微镜下观察，并随机选择5个视野拍照，用ImageJ软件计算划痕面积，并计算各组的相对迁移率，相对迁移率/% =(各药物组0 h划痕面积-24 h划痕面积)/(对照组0 h划痕面积-24 h划痕面积)×100%。

2.4 Transwell侵袭实验用无血清的DEME培养基按8 ∶1的比例稀释Matrigel胶并充分混匀,将混合液均匀铺于Transwell小室膜上,每孔100 μL，置于37 ℃的条件下 4 h，待其凝固。用胰蛋白酶消化HCT-116细胞，无血清培养基重悬后,在Transwell小室的上室中每孔接种5×104个细胞和含不同终浓度BRU(0、3、6 nmol·L-1)的无血清培养基。在每孔的下室加入500 μL DMEM(含20%胎牛血清)培养基,置于孵箱中培养24 h后,用棉花轻轻擦掉上室中未侵袭的细胞，室温下用4%多聚甲醛固定小室的底部15 min,PBS漂洗1-2次,结晶紫染色15 min,显微镜下每组随机选取5个视野观察并拍照。

2.5 Western blot检测将HCT-116细胞分为3组，分别加入含不同终浓度BRU(0、3、6 nmol·L-1)的DMEM完全培养基,放细胞孵育箱24 h后收集细胞；再将HCT-116细胞分为4组，分别为对照组，加药组(BRU)，抑制剂组(Y27632)，加药和抑制剂组(BRU+Y27632)，先后提取蛋白进行SDS-PAGE电泳,然后电转至PVDF膜上，在室温条件下，用无蛋白快速封闭液封闭15 min，分别加入稀释比例均为1∶1 000的一抗MMP2、MMP9、RhoA、ROCK1和GAPDH，置于4 ℃冰箱的摇床过夜。用TBST液洗涤3次后,加入适量稀释比例为1 ∶10 000的二抗，在室温状态下放入摇床孵育1 h，再用TBST液洗涤3次，使用ECL系统检测蛋白表达量。实验重复3次。

3 结果

3.1 BRU对HCT-116细胞增殖的影响如Fig1所示，使用CCK-8法检测不同浓度的BRU作用于HCT-116细胞24、48、72 h后，与对照组相比，HCT-116细胞的抑制率随着BRU作用时间和浓度的增加而逐渐增加。计算BRU作用于HCT-116细胞24、48、72 h的IC50分别为16.62、15.11、13.42 nmol·L-1，24 h的IC10为6 nmol·L-1，所以后续选用6 nmol·L-1作为最大药物处理浓度。

Fig 1 Effect of BRU on proliferation of HCT-116 cells by

3.2 BRU抑制HCT-116细胞的迁移划痕实验检测BRU对HCT-116细胞迁移能力的影响。如Fig2所示，使用0(对照组)、3、6 nmol·L-1的BRU处理HCT-116细胞24 h后，各组的相对迁移率为(49.3±1.5)%、(31.2±10.4)%、(8.9±2.6)%。与对照组相比，加药组细胞迁移率逐渐降低，差异有统计学意义(P<0.05)。提示BRU能够明显抑制HCT-116细胞的迁移。

Fig 2 Effect of BRU on HCT-116 on migration of colorectal cancer cells by wound healing n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs control

3.3 BRU抑制HCT-116细胞的侵袭将Matrigel胶稀释后均匀铺在Transwell小室的上室中，用于检测HCT-116细胞的侵袭能力。如Fig3所示，使用0(对照组)、3、6 nmol·L-1的BRU处理HCT-116细胞后，各组的每视野下侵袭过膜细胞数为(760±26)个、(532±57)个、(353±8)个。与对照组相比，加药组中HCT-116细胞的侵袭能力明显减弱，差异有统计学意义(P<0.01)。提示BRU能够显著抑制HCT-116细胞的侵袭。

Fig 3 Effect of BRU on invasion of HCT-116 colorectal cancer cells by Transwell n=3)**P<0.01 vs control

3.4 BRU对HCT-116细胞中迁移侵袭相关蛋白MMP2、MMP9表达的影响用不同浓度的BRU(0、3、6 nmol·L-1)处理HCT-116细胞24 h后，Western blot检测结果显示，与对照组(即0 nmol·L-1BRU处理组)相比，经BRU处理后的加药组中的MMP2、MMP9蛋白的相对表达量均明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果提示BRU可以抑制迁移侵袭相关蛋白的表达。见Fig4。

3.5 BRU对RhoA/ROCK1通路相关蛋白表达的影响用不同浓度的BRU(0、3、6 nmol·L-1)处理HCT-116细胞24 h后，Western blot检测结果显示，与对照组(即0 nmol·L-1BRU处理组)相比，经BRU处理后的加药组中的RhoA、ROCK1蛋白的相对表达量均明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果提示BRU可以抑制RhoA、ROCK1蛋白的表达，见Fig5。

Fig 4 Effect of BRU on expression of MMP2,MMP9 protein in HCT-116 cells n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs Control

Fig 5 Effect of BRU on expression of RhoA,ROCK1 protein in HCT-116 cells n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs Control

3.6 BRU和Y27632对ROCK通路相关蛋白表达的影响用BRU(6 nmol·L-1)和ROCK抑制剂分别处理HCT-116细胞，再用BRU和Y27632共同处理HCT-116细胞后，将细胞收集进行Western blot检测。结果显示，与对照组相比，经BRU或Y27632处理后的加药组中的RhoA、ROCK1、MMP2和MMP9蛋白的相对表达量均减少，经BRU和Y27632共同处理后的HCT-116细胞中RhoA、ROCK1、MMP2和MMP9蛋白表达量减少更为明显，差异具有统计学意义(P<0.01)。结果提示BRU和Y27632一样，都能抑制ROCK通路相关蛋白的表达，见Fig6。

Fig 6 Effect of BRU and Y27632 on expression of ROCK signaling pathway related proteins in HCT-116 cells n=3)**P<0.01 vs Control

4 讨论

结直肠癌(CRC)是全球第三大最常见的恶性肿瘤，也是全球第四大癌症相关的死亡原因。结直肠癌是一种多因素的疾病，与遗传、环境和生活方式等多种危险因素有关[8]。目前结直肠癌的预后仍然较差，约50%的患者在手术后2年内死亡[9]。中医学里无结直肠癌的说法，从其发病的特征和临床表现分析，通常将其归于“肠积”、“肠风”、“脏毒”等病的范畴。中医认为外感湿热或脾胃损伤导致水湿内生，郁久化热，是结直肠癌发病的重要原因。本病的主要病因是湿热，故以清热利湿、化瘀解毒为治疗原则[10]。长期以来，人们一直在研究中草药的天然产品作为癌症治疗的潜力药物。研究中药对结直肠癌的治疗或许将是提高其预后的新思路。

鸦胆子作为一种常用中药,性苦味寒，入大肠经、肝经，具有清热、燥湿、解毒、杀虫、止痢的作用,是一种非常有开发价值的药物。鸦胆子苦醇(BRU)是一种从鸦胆子籽中提取的类黄酮类化合物，最近的研究证明，BRU可以抑制肺癌细胞Nrf2信号通路，从而抑制肺癌细胞的抗氧化功能，增加放化疗造成的DNA损伤，提高化疗药物的疗效[11]。同时，Nrf2作为维持氧化还原稳态的关键调节因子，已被证明与癌症的侵袭性增殖等恶性表型有关[12]。因此，作为Nrf2的特效抑制剂，BRU在多种癌症中的肿瘤抑制作用越来越受到重视。临床试验表明，BRU可有效抑制胰腺癌、肝癌、前列腺癌等癌细胞的增殖,是潜在的天然抗肿瘤药物[13]。但其对结肠癌的影响还未见报道。因此，本文旨在研究BRU对结肠癌迁移和侵袭的影响和作用机制。

本研究采用CCK-8法检测了BRU对HCT-116细胞的增殖抑制作用，结果表明HCT-116细胞的增殖能被BRU显著抑制，且呈浓度和时间依赖性。选取BRU对HCT-116细胞24 h的IC10作为最大加药浓度,进一步探究BRU对HCT-116细胞迁移和侵袭的影响。通过划痕实验和Transwell实验的结果显示较低浓度的BRU就可以显著抑制结直肠癌细胞HCT-116的迁移和侵袭,且呈浓度依赖性。

肿瘤的转移是涉及肌动蛋白结构的动态形成和分解引发的多因素和多细胞过程[14]。这些过程又涉及Rho亚家族(RhoA、RhoC)，活化的RhoA通常调节肌动蛋白应激纤维的形成并影响肌动球蛋白的收缩性。RhoA的下游因子是Rho相关的卷曲螺旋激酶1(ROCK1)，活化的RhoA激活ROCK1，使肌球蛋白磷酸酶磷酸化而失活，导致磷酸化的肌球蛋白不能脱磷酸化，使得胞质内磷酸化的肌球蛋白水平增加，增加肌动蛋白与肌球蛋白的相互作用,引起细胞的黏附、侵袭和迁移[15]。大量研究发现，RhoA/ROCK1信号通路在细胞迁移时能调节细胞的黏附、形态变化和细胞骨架拉伸，这对癌症转移具有重要影响。RhoA的激活可以促进结直肠癌细胞的增殖和转移，而靶向RhoA/ROCK1信号通路是抑制结直肠癌转移的可行方法。在本实验中，用不同浓度BRU处理结肠癌细胞HCT-116后RhoA和 ROCK1的蛋白水平明显下调。提示BRU可能通过RhoA/ROCK1信号通路抑制结肠癌细胞HCT-116的迁移和侵袭。

基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinases，MMPs)是一类活性上依赖钙离子和锌离子的蛋白水解酶,它能降解细胞外基质和细胞基底膜，从而导致细胞局部缺损[16]。由于MMPs的表达对于肿瘤转移表现出较强的相关性，在过表达MMPs的结直肠癌细胞中，其迁移与侵袭能力增强,所以抑制MMPs的表达可能是治疗结直肠癌的潜在有效方式[17]。以往的研究表明，ROCK抑制剂Y27632可以抑制HCC的进展和肝内转移，这可能与肿瘤细胞中MMP2、MMP9表达的降低有关。除了迁移的影响外，ROCK在肿瘤的发生和发展的大多数步骤中都起着作用，包括增殖、侵袭和转移。RhoA/ROCK在胶质母细胞瘤中的表达增加，并与肿瘤细胞的恶性程度呈正相关，ROCK参与了MMPs的调控，MMP2的表达可以被ROCK抑制剂法舒地尔所抑制[18]，提示MMPs是RhoA/ROCK1信号通路的下游。本研究中，经BRU处理后的HCT-116细胞中的RhoA、ROCK1、MMP2和MMP9蛋白水平下调，与Y27632处理后的结果一致，提示BRU可能是一种潜在的RhoA/ROCK通路抑制剂，能够通过RhoA/ROCK1信号通路抑制MMP2和MMP9蛋白的表达，进而抑制HCT-116细胞的迁移和侵袭。

综上所述，BRU可能通过RhoA/ROCK1信号通路抑制结肠癌细胞HCT-116的迁移和侵袭。提示BRU对结肠癌细胞HCT-116有良好的抗肿瘤活性，是一种治疗结肠癌的潜在有效药物，RhoA/ROCK1信号通路是一个治疗结直肠癌的有前景的靶点，对其作用机制的进一步研究有助于发现BRU潜在的药理作用。