舒郁胶囊对孕前社会挫败应激大鼠子代学习记忆能力及CREB-BDNF信号通路的影响

刘 坤，邢 影，史经昊，李自发，耿希文，魏 盛

(山东中医药大学 1.中医学院 2.实验中心，山东 济南 250355)

抑郁症是一种常见的情绪类疾病，除抑郁、情绪低落等症状外还伴有认知功能障碍。该病存在遗传倾向，其后代患抑郁症的概率高达40%[1]。已有研究证明母代产前应激会对子代的神经发育及认知功能产生影响[2]。中医理论认为，肝疏泄不及[3]是抑郁症发病的关键病机之一。舒郁胶囊作为柴胡、白芍、香附、甘草有效成分提取物组成的中成药广泛应用于抑郁症等情绪类疾病的治疗[4]，有研究证实[5]其组分芍药苷可缓解孕前应激引起的子代抑郁症状，但其改善学习认知能力的药效研究未见报道。本研究通过社会挫败应激[6](social defeat stress，SDS)制备母鼠抑郁样行为(肝疏泄不及状态)并进行舒郁胶囊干预，通过行为学测试对子代学习记忆能力进行评价，并探讨舒郁胶囊通过调节CREB-BDNF信号通路改善此症状的神经生化机制。

1 材料

1.1 实验动物Wistar子代雄性大鼠48只，体质量(180-200)g，用于交配的雌鼠及雄鼠、造模入侵鼠均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SYXK(鲁)20170022。

1.2 药品、主要试剂及仪器舒郁胶囊(山东中医药大学天然药物研究所自制)；盐酸氟西汀分散片(礼来苏州制药有限公司，批号9515A)。抗-BDNF抗体(1 ∶200，Sigma，AV41970)，抗-CREB抗体、抗-pCREB抗体、(1 ∶500，Abcam，ab31387、ab32096)抗GAPDH抗体(1 ∶2500，Abcam，ab9485)过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗(1 ∶2 000，Santa Cruz，sc-2004)。XR-SuperMaze动物行为分析系统、XR-XZ301旷场实验系统、物体识别实验系统、Morris水迷宫实验系统(上海欣软信息科技有限公司)；电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)；优普去离子水机(成都超纯科技有限公司)；5024R冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；G:BOX ChemiXR5凝胶成像分析系统(美国SYNGEN公司)。

2 方法

2.1 母代大鼠模型制备及行为学评价根据大鼠旷场实验及体质量将大鼠随机分为4组，每组10只。分别为正常组(纯水10 mL·kg-1·d-1)、模型组(纯水10 ml·kg-1·d-1)、舒郁胶囊组(408 mg·kg-1·d-1)、氟西汀组(2.67 mg·kg-1·d-1)。造模持续4周，第1周大鼠单笼饲养进行社会隔离，第2周开始进行社会挫败入侵实验[7](将入侵鼠转移至居住鼠笼中15 min，记录在此期间入侵鼠与居住鼠的行为。若入侵鼠对居住鼠有攀压行为且持续时间超过2 s，则被定义为“挫败”)，共进行3周。造模期间同时给药。造模后通过挫败率及旷场实验、糖水偏好实验对母代大鼠进行行为学评价，筛选合格大鼠与雄性大鼠交配。

2.2 子代雄性大鼠学习记忆相关行为指标检测雄性子代满2月龄后对其进行行为学测试，通过物体识别实验及Morris水迷宫实验评价各组大鼠学习记忆能力。

2.2.1物体识别实验(Object Recognition Task，ORT) 子代大鼠于旷场区域(箱体尺寸：长×宽×高=40 cm×40 cm×40 cm)连续测试4 d。d 1和d 2的上午10 ∶00进行5 min的自由探索以适应环境。d 3将大鼠放入旷场中心，在靠近旷场一侧区域墙壁放入两个相同的物体进行5 min训练，训练结束后将大鼠放回原笼，1 h后再次将大鼠放入旷场区域。此时旷场内放入一个与之前相同的物体(未使用过)以及一个陌生物体，记录大鼠5 min中内探索每个物体的时间。d 4动物再次放入旷场箱中，放入一个熟悉物体及一个陌生物体,记录大鼠在5 min内探索每个物体的时间。每次实验结束，用75%酒精溶液擦拭箱体。最后根据识别指数(recognition index,RI)即探索陌生物体的时间与探索物体的总时间之比，作为物体识别的主要指标。若RI=50%表示零偏爱，>50%则认为大鼠更倾向于探究陌生物体，<50%表示倾向于探索熟悉物体。

2.2.2Morris水迷宫实验(Morris Water Maze，MWM) 水迷宫实验在Morris水迷宫(直径：160 cm，高度：60 cm)中进行,水迷宫被均分为四个象限，内有一个平台(直径：12 cm，高度：35 cm)，随机放于一个象限。测试时水深37 cm，水温(25±2)℃。实验分为定位航行训练及空间探索测试两部分。

定位航行训练：训练期为4 d,每天将大鼠从不同的象限面向池壁放入水中，大鼠自由游泳2 min，记录逃避潜伏期(自开始计时至找到平台的时间)及平台象限停留时间。若大鼠在2 min内未找到平台，将大鼠放到平台上停留15 s,其潜伏期记为2 min。

空间探索测试：d 5将平台撤去，从任意一个象限将大鼠放入水迷宫，同时保证所有大鼠在同一入水点记录并分析大鼠2 min内逃避潜伏期、原平台象限的停留时间。

2.3 Western blot检测子代雄性大鼠海马脑区蛋白行为学结束后取海马脑区，Western blot检测海马内BDNF、pCREB、CREB含量。取海马组织内总蛋白，蛋白定量后上样、电泳分离、转膜、洗膜，先后加入一抗及二抗孵育、洗涤。用ECL化学发光试剂盒显像后，使用G:BOX chemiXR5成像。

2.4 统计学方法数据使用GraphPad Prism 8.0统计软件进行分析，多组比较用单因素方差分析，连续测量的数据采用重复测量设计的双因素方差分析。

3 结果

3.1 各组大鼠物体识别实验结果与正常组母鼠子代相比，模型组物体识别实验1 h及24 h识别指数明显下降(P<0.01,P<0.01);与模型组相比，氟西汀干预组1 h及24 h识别指数上升(P=0.01,P<0.01),舒郁胶囊干预组1 h及24 h识别指数上升(P<0.05,P<0.01)，见Fig1。

Fig 1 Comparison of object recognition task behaviors of maternal offsprings in different treatment groupsA:The movement track of rats in ORT (1 h retention interval);B:The movement track of rats in ORT (24 h retention interval);C:Comparison of recognition index of 1 h and 24 h retention interval of maternal offsprings in different treatment groups.1:Control progency;2:Stress progency;3:Stress+fluoxetine progency;4:Stress+shuyu progency;**P<0.01 vs Control group;#P<0.05，##P<0.01 vs Stress group.

3.2 各组大鼠Morris水迷宫实验结果与正常组母鼠子代相比，模型组Morris 水迷宫探索期目标象限停留时间明显下降，逃避潜伏期明显上升(P<0.01,P<0.01)；与模型组相比，氟西汀干预组探索期目标象限停留时间上升，逃避潜伏期明显下降(P<0.05,P<0.01)，舒郁胶囊干预组探索期目标象限停留时间上升，逃避潜伏期明显下降(P<0.05,P<0.01),见Fig2。

Fig 2 Comparison of Morris water maze behavior experiment of maternal offsprings in different treatment groups during training period and exploration periodA：Comparison of target quadrant residence time in offsprings of different treatment groups in training period;B：Comparison of escape latencies in offsprings of different treatment groups in training period;C：Comparison of target quadrant residence time and escape latency of offsprings in different treatment groups in exploration period;D：The movement track of rats in MWM.1:control progency;2:Stress progency;3:Stress+fluoxetine progency;4:Stress+shuyu progency；**P<0.01 vs control group;#P<0.05，##P<0.01 vs Stress group

3.3 各组大鼠海马脑区微观指标检测结果与正常组母鼠子代相比，模型组BDNF相对光密度值明显降低 (P<0.01)；与模型组相比，氟西汀及舒郁胶囊干预组BDNF相对光密度值升高 (P<0.01,P<0.01)。各组CREB相对光密度值未表现出明显差异。与正常组母鼠子代相比，模型组pCREB相对光密度值明显降低 (P<0.01)；与模型组相比，氟西汀干预组pCREB相对光密度值升高 (P<0.01)。与正常组母鼠子代相比，模型组pCREB/CREB比值降低 (P<0.01)；与模型组相比，氟西汀及舒郁胶囊干预组pCREB/CREB比值升高(P<0.01，P<0.01),见Fig3。

Fig 3 Comparison of relative optical density values of BDNF,CREB and pCREB in hippocampus of maternal offsprings in different treatment groupsA：Comparison of the relative optical density values of BDNF,CREB,pCREB and pCREB/CREB in maternal offspring hippocampus of different treatment groups；B：Electrophoretic bands of BDNF,CREB,pCREB and GAPDH in maternal offspring hippocampus of different treatment groups；1:control progency;2:Stress progency;3:Stress+fluoxetine +progency;4:stress+shuyu progency;**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs Stress group

4 讨论

本研究采用更为接近社会环境应激的社会挫败应激范式制备母鼠孕前抑郁样行为(肝疏泄不及状态)，并进行舒郁胶囊干预后，各组成年雄性子代的ORT、MWM等行为学指标及海马脑区BDNF、pCREB等微观指标的表达结果显示，母鼠孕前应激会降低成年雄性子代学习记忆能力，此负性影响可经中药舒郁胶囊干预而得到改善，其作用的微观机制可能与舒郁胶囊上调海马内pCREB、BDNF的表达，调节CREB-BDNF通路有关。

母鼠孕前应激会使子代产生抑郁行为[8]并可以导致子代认知缺陷[9]，已有研究证实母鼠孕前应激对子代的负性影响可能与下调海马区pCREB水平，并降低BDNFmRNA的转录及表达水平[10]有关。海马是参与学习与记忆的重要脑区[11]，BDNF除了发挥神经营养因子的作用外，在调节海马长时程增强中也起到重要作用,是抑郁症相关神经生理学研究热点[12]。BDNF是CREB的经典下游靶基因，CREB是认知功能调节的关键介质[13]，其磷酸化形式pCREB可以改善大鼠认知功能[14]；而pCREB可以促进BDNF的表达[15]。有研究报道抗抑郁药物可以激活细胞膜的腺苷酸环化酶(adenylate cyclase，AC)，催化ATP产生cAMP,cAMP可激活蛋白激酶A使CREB磷酸化[16],进而通过CREB-BDNF通路发挥作用。故 CREB-BDNF通路在调节学习认知功能中发挥重要作用。

舒郁胶囊主要由柴胡皂苷、芍药苷、香附挥发油等组成，是临床治疗抑郁症的有效药物，而我们的研究发现，舒郁胶囊具有改善母代孕前社会挫败应激导致的成年雄性子代学习记忆减退的效果。以往对舒郁胶囊药效机制的研究多基于其改善抑郁样表型的作用开展，而对其干预学习记忆的药效鲜见报道。我们的研究发现舒郁胶囊可以通过上调孕前社会应激制备的肝疏泄不及大鼠模型子代海马BDNF表达，提高pCREB/CREB比值，行为学结果显示母代孕前社会挫败应激导致的子代学习记忆能力减退的症状得到改善。因此，舒郁胶囊对于子代大鼠学习记忆能力的调节作用可能是通过CREB-BDNF通路实现的。

本研究结果为调肝方药舒郁胶囊改善学习记忆作用的中枢机制提供了方向和支持，并为扩展该药物的临床应用范围奠定了数据基础。然而，中药可从多环节、多靶点发挥作用，仅从单一方面阐发舒郁胶囊改善学习记忆能力是不够的。舒郁胶囊在提高大鼠学习记忆能力中发挥作用的具体部位及作用的特定神经环路还需要进一步的探索和论证。