4-羟基芝麻素通过抑制p38MAPK/NLRP3信号通路减轻BV2小胶质细胞神经炎症损伤

张 庆，倪 林，黄贞伟，张小琴，林 埔

(1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002)

4-羟基芝麻素(4-hydroxysesamin)属于双四氢呋喃木脂素类成分，存在于叶下珠、黄荆、香樟等中药中。以芝麻素为代表的双四氢呋喃类成分具有抗肿瘤、抗脑卒中等作用[1-2]，但有关4-羟基芝麻素对神经炎症反应的抑制作用及可能机制未见报道。因此，本实验以课题组前期从香樟中获得的4-羟基芝麻素为研究对象[3]，采用LPS诱导的BV2小胶质细胞神经炎症模型，探讨其对小胶质细胞神经炎症反应是否具有保护作用及可能作用机制，从而为从中药中寻找神经保护类药物提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 药品及主要试剂4-羟基芝麻素(由福建农林大学植物保护学院倪林副教授提供，纯度>98%)；脂多糖(Sigma，批号：L2630)；caspase-1 p20(SANTA CRUZ公司，批号：SC-398715)；IL-18(ab207323)、NLRP3(ab263899)均购自abcam公司；p38(8690S)、Phospho-p38(4511S)、COX-2(12282)、兔二抗(7074)均购自CST公司；鼠二抗(北京全式金生物技术有限公司，批号：HS101-01)。

1.2 主要仪器光学显微镜(Thermo Fisher公司)；酶标仪(TECAN公司)；7900H荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司)；电泳仪、化学发光成像仪(BIO-RAD公司)。

1.3 药物制备精密称取4-羟基芝麻素适量，溶于含20% DMSO的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为100 mmol·L-1的母液备用。

1.4 细胞培养复苏BV2小胶质细胞(中国典型培养物保存中心)，培养于DMEM完全培养基中每天换液、隔天传代，供后续实验使用。

1.5 MTT法检测BV2小胶质细胞存活率将BV2小胶质细胞分为正常对照组(C)、LPS模型组(100 ng·L-1)、4-羟基芝麻素低剂量组(10 μmol·L-1，4-hydroxysesamin-L)、4-羟基芝麻素中剂量组(20 μmol·L-1，4-hydroxysesamin-M)、4-羟基芝麻素高剂量组(40 μmol·L-1，4-hydroxysesamin-H)。采用MTT法检测细胞存活率。

1.6 ELISA法检测BV2小胶质细胞中IL-6、IL-1β的含量将BV2小胶质细胞接种于6孔板中，分组同“1.5”。采用ELISA法检测细胞上清中IL-6、IL-1β的含量。

1.7 Western blot法检测BV2小胶质细胞中p38MAPK/NLRP3通路相关蛋白表达水平BV2小胶质细胞种板、造模和给药同“1.6”。蛋白经电泳、转膜、封闭后，加入一抗(COX-2、p38、p-p38、NLRP3、caspase-1 p20、IL-18、β-actin)和相应二抗，再置于凝胶成像系统中显影，最后使用Image Lab软件分析图像。

2 结果

2.1 4-羟基芝麻素对BV2小胶质细胞存活率的影响结果表明，与正常对照组相比，BV2小胶质细胞存活率在LPS(100 ng·L-1)干预12 h的条件下无明显变化；与LPS组相比，4-羟基芝麻素(10、20、40 μmol·L-1)对细胞存活率无显著影响。

2.2 4-羟基芝麻素对LPS诱导的BV2小胶质细胞IL-6、IL-1β分泌水平的影响Tab 1结果表明，与正常对照组比较，LPS干预12 h后，BV2小胶质细胞上清中IL-6、IL-1β的水平明显上升(P<0.01)；与LPS模型组比较，随着4-羟基芝麻素浓度的增大，BV2小胶质细胞上清中IL-6、IL-1β的含量明显下降(P<0.05或P<0.01)。

Tab 1 Effect of 4-hydroxysesamin on levels of IL-6,IL-1β in LPS-induced BV2 microglial cells n=3)

2.3 4-羟基芝麻素抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞中p38MAPK/NLRP3通路的激活Tab 2结果表明，与正常对照组比较，LPS干预12 h后，BV2小胶质细胞中p-p38、NLRP3、caspase-1 p20、IL-18、COX-2蛋白表达均明显上升(P<0.05或P<0.01)；与LPS模型组比较，随着4-羟基芝麻素浓度的增大，BV2小胶质细胞中p-p38、NLRP3、caspase-1 p20、IL-18、COX-2的蛋白表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。

Tab 2 Effect of 4-hydroxysesamin on protein expression of p38MAPK/NLRP3 signaling pathway related proteins in LPS-induced BV2 microglial cells n=3)

3 讨论

神经炎症反应是中枢神经系统的一种免疫应答反应，在缺血性脑卒中、神经退行性疾病中发挥着重要的调节作用。当中枢神经系统发生炎症反应时，小胶质细胞被迅速激活、发生增殖并迁移至损伤部位，释放大量炎症介质及细胞毒素，如IL-6、TNF-α等[4]。促炎介质的过度产生会进一步加重炎症浸润和免疫反应，导致神经元损伤。因此，抑制小胶质细胞过度活化所导致的神经炎症反应，对保护神经元、恢复神经功能具有重要作用。本实验结果表明，4-羟基芝麻素可明显抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞中IL-6的分泌，以及COX-2蛋白水平的表达。

NLRP3炎症小体是一种大分子量的胞质蛋白复合体，由NLRP3、ASC和效应蛋白pro-caspase-1组成。缺血性脑卒中发生后，无活性的NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18发生转录，实现NLRP3、ASC和pro-caspase-1的组装，进而催化IL-1β和IL-18的成熟和分泌，促进炎症反应，加重缺血性脑卒中损伤[5]。p38MAPK信号通路可以通过促进炎症细胞因子和趋化因子的产生，进而促进NLRP3炎症小体的激活[6]。实验结果表明，4-羟基芝麻素可明显抑制p38蛋白磷酸化，降低NLRP3、caspase-1 p20的蛋白表达，进而减少IL-18、IL-1β的释放。

综上可见，4-羟基芝麻素可能通过抑制p38MAPK/NLRP3信号通路，降低促炎性蛋白酶COX-2的表达，抑制炎症因子IL-6的释放，进而发挥抑制BV2小胶质细胞神经炎症反应的作用。