藏红花红O家兔肾病模型的制备及地塞米松缓释剂的保护作用

孙雪梅，吕心蕊，储 伟，朱晓筱，周兰兰

(1.安徽医科大学药理学教研室，安徽 合肥 230022；2.深圳职业技术学院医护学院，广东 深圳 518055)

肾病综合征(nephrotic syndrome，NS)是一种由多种病因引发，以肾小球基底膜通透性升高为主的原发性肾脏疾病，这种疾病的临床症状是高尿蛋白、高度水肿、高脂血症和低蛋白血症，对身体危害较大[1-2]。研究显示，在肾脏疾病中，当肾小球滤过的通透性增大时，会导致体内大量蛋白质随尿液排出。高尿蛋白不仅是肾脏受损的一个指标，还是肾病发生发展的一个重要因素[3]。高蛋白尿与肾小球足细胞足突间裂孔隔膜受损及相关蛋白的表达异常导致肾小球滤过屏障的破坏密切相关。Nephrin是首个被发现且证实与滤过屏障相关的足细胞蛋白[4]。瞬时性受体电位通道6(transient receptor potential 6，TRPC6)是跨膜蛋白通道蛋白，主要分布在肾小球外层的足细胞中，同时在内皮细胞和系膜上也有表达。TRPC6作为非选择性的阳离子通道，主要介导钙离子的内流，并激活下游信号。有研究结果发现足细胞受损会导致TRPC6蛋白的升高[5-6]，nephrin蛋白和TRPC6蛋白两者间有共定位并且受同一种酶的调节，本实验进一步研究nephrin蛋白和TRPC6蛋白在肾病发展过程中的作用。

目前，肾病综合征的临床治疗主要用糖皮质激素((glucocorticoid，GC)及其他免疫抑制剂，虽能控制病情，但长期应用可能会导致感染、高血糖及股骨头坏死等严重并发症[7-8]。地塞米松(dexamethasone，Dex)是GC类药物，因其抗炎、抗过敏、休克、抗毒等疗效强大，极易产生与治疗目的无关的反应，限制其临床的应用。如何能在确保其发挥最大治疗效果的前提下尽可能降低毒副作用，成为摆在临床及药物研制者面前的一道难题。地塞米松缓释剂(sustained-release of dexamethasone，SR Dex)作为一种新型的长效药[9]，采用肾囊内植入给药，可使药物持续恒速释放，使病灶部位血药浓度持续稳定在治疗范围内，因而可能具有非常好的治疗效果。前期研究结果显示，SR Dex对阿霉素肾病大鼠具有良好的保护作用[10]。本文进一步研究了SR Dex对藏红花红O家兔肾病模型的保护作用及机制，旨在为其今后的临床应用提供充足的理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲养雄性普通级新西兰家兔，购自江苏省南京江宁区青龙山动物场，生产许可证号：SCXK(苏)2012-0008，体质量(2.0-2.5)kg。家兔(每只/笼)正常摄取水和食物，(21-23)℃温度和40%-70%湿度的饲养环境中饲养3 d后实验。

1.2 主要药品试剂与仪器地塞米松植入剂及受试药的辅料，由安徽四维药业提供，临用前装入消毒的植入剂专用植药针。醋酸地塞米松，购自浙江仙琚制药公司。臧红花红O(SafraninO)：购自Simga公司。nephrin(bs-4866R，1 ∶100)抗体和TRPC6(bs-2393R,1 ∶100)抗体均购自北京博奥森生物科技有限公司。高速冷冻离心机：德国Leica。ZH-B6型家兔代谢笼：购自正华生物仪器设备公司。Spectra Max 190全波长酶标仪：Molecular Devices。RM2255全自动切片系统：德国Leica。7500Real-Time PCR仪：Applied Biosystems。

1.3 家兔臧红花红O肾病模型制备[11-12]及肾囊注射术臧红花红O肾病模型采用连续二次兔耳缘静脉注射1%臧红花红O方法，首次注射剂量15mg/只，3 h后再次注射15mg/只。家兔耳缘静脉注射戊巴比妥钠(30 mg·kg-1)麻醉，然后在无菌条件下从背部做切口，分别暴露两侧肾脂肪囊，用植入受试药的专用植药针肾囊内注射，逐层缝合，缝合处滴少许10 U单位青霉素钠溶液。

1.4 实验分组及给药家兔按体重随机分为：对照组、假手术组、肾病模型组。造模1周后，肾病模型组分为模型组，受试药辅料组、受试药高中低剂量组、地塞米松阳性对照组。模型组只做肾囊穿刺，受试药辅料组注射空白对照粒子(0.74 mg·kg-1)，受试药组注射不同剂量的药物(1.48、0.74、0.37 mg·kg-1)，假手术组除不注射给药外，其他操作相同。阳性对照组采用灌胃给药(0.4 mg·kg-1，q.d.)，持续给药至第8周。

1.5 肾病家兔血液和尿液生化指标检测取家兔的尿液和血液检测尿素氮和血肌酐的含量，来评估肾脏功能的损伤程度。其中尿液检测的时间点为：造模前、造模1周后、用药后每周1次。血液检测的时间点为：造模前、造模1周后、用药后每周2次。

1.5.124 h尿蛋白检测(urinary protein,mg·d-1) 收集24 h内的尿液，收集尿液时禁食。从收集的尿液总量中取3 mL，在3 000 r·min-1的条件下离心5 min，取上清液测含量。采用双缩脲法进行测定，将测得结果乘以24 h内总尿液量，即得24 h尿蛋白的量。

1.5.2血肌酐(creatinine，Cr)和尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)的测定 耳缘动脉取血法采集血液，至于EP管中，室温静置1 h，在4 000 r·min-1的条件下离心10 min，取上清进行测量。采用苦味酸肌酐反应测血清中肌酐的含量，酸性试剂反应测尿素氮的含量，然后分别在510 nm和540 nm的条件下分别测OD值，用标准曲线法，分别计算求出血肌酐和尿素氮的量。

1.6 肾组织病理学检测家兔麻醉后处死，取出肾组织分别进行PAS染色和天狼猩红(sirius red，SR)染色，染色的具体实验操作详见试剂盒说明书指导，试剂盒购自Abcam公司。

1.7 免疫组化法(immunohistochemistry，IHC)检测肾组织中Nephrin和TRPC6蛋白的表达家兔麻醉后处死，取出肾脏用免疫组化试剂盒检测Nephrin、TRPC6蛋白表达，具体实验操作详见试剂盒说明书指导，试剂盒购自Simga公司。在显微镜下(400x)进行拍照，随机取5个视野，用ImageJ进行分析，测平均光密度。

1.8 Real-time PCR检测肾组织中Nephrin、TRPC6 的mRNA水平家兔麻醉后处死，取肾组织用TRIzol Reagent提取总RNA，TRIzol购自美国Invitrogen公司。基因序列如下：β-actin，F：5′-TTCCTTCC TGGGTATGGAAT-3′和R：5′-GAGGAGCAATGATCT TGATC-3′。Nephrin，F：5′-AGCCAGGAGCGTCTTTC TC-3′和R：5′-ACAGCACATTGAGGCGGTA-3′。TRPC6，F：5′-TTCCTGTTCCCTTCAACCTG-3′和R：5′-TCTGCATCCTCTTGGAAACC-3′。操作步骤严格按照Tli RNaseH Plus试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 SR Dex对藏红花红O肾病家兔24 h尿蛋白的影响如Tab 1所示，与对照组相比，模型组、辅料组在造模1周后，家兔24 h内的尿蛋白显著增加，直至实验第9周差异均有显著性(P<0.01)。与模型组相比，SR Dex不同剂量组在第3-8周时尿蛋白降低，差异具有统计学意义(P<0.01)；阳性对照组在第4-8周时尿蛋白降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.2 SR Dex对藏红花红O肾病家兔血肌酐和血尿素氮的影响如Tab 2所示，与对照组相比，模型组、辅料组在造模后第1-9周血肌酐和尿素氮的含量均显著增加，差异均具有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比，SR Dex不同剂量组在第2-8周血肌酐的量均减少，差异均具有统计学意义(P<0.01)；SR Dex高剂量组在第1-8周尿素氮的含量明显降低(P<0.05)，SR Dex中、低剂量组在第3-8周尿素氮降低(P<0.01)。阳性对照组血肌酐和尿素氮的含量分别在第2-8周和第3-8周下降，差异均具有统计学意义(P<0.01)。

Tab 1 Effect of SR Dex on urinary protein in safranine O-induced nephritis rabbits n=10)

续Tab 1

Tab 2 Effect of SR Dex on serum creatinine and urea nitrogen in safranine O-induced nephritis rabbits n=10)

续Tab 2

2.3 SR Dex对藏红花红O肾病家兔肾组织病理学的影响如Fig1所示，与对照组比较，模型组、辅料组中肾小球上皮系膜面积变大，基底膜明显加厚。SR Dex不同剂量组和阳性对照组均可不同程度的减轻肾组织病理损伤。

Fig 1 Effect of SR Dex on renal tissue histopathology in safranine O-induced nephritic rabbits n=3)A:control;B:Sham;C:model;D:Accessory;E-G:SR Dex 0.37,0.74,1.48 mg·kg-1;H:Dex 0.4 mg·kg-1.

如Fig2所示，与对照组比较，模型组和辅料组间质纤维深染，肾小球的脂类沉积增重。SR Dex不同剂量组和阳性对照组均可不同程度的缓解间质纤维深染和脂类沉积。

2.4 SR Dex对藏红花红O肾病家兔肾组织中nephrin表达的影响如Fig3所示，对照组、假手术组中nephrin呈棕色黄染颗粒状。与对照组相比，模型组和辅料组nephrin分布减少，染色强度减弱，差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比，SR Dex不同剂量组和阳性对照组可不同程度的增加nephrin蛋白的含量，差异均具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。

Fig 2 Effect of SR Dex on renal tissue histopatholopy in safranine O-induced nephritis rabbits (SR×200) n=3)A:control;B:Sham;C:model;D:Accessory;E-G:SR Dex 0.37,0.74,1.48 mg·kg-1;H:Dex 0.4 mg·kg-1.

Fig 3 Effect of SR Dex on nephrin protein expression of renal tissues in safranine O-induced nephritic rabbits (IHC×200) n=4)A:control;B:Sham;C:model;D:Accessory;E-G:SR Dex 0.37,0.74,1.48 mg·kg-1;H:Dex 0.4 mg·kg-1.**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs model

2.5 SR Dex对藏红花红O肾病家兔肾组织中TRPC6表达的影响如Fig4所示，对照组、假手术组TRPC6呈棕色黄染颗粒状。与对照组相比，模型组和辅料组TRPC6含量明显增多，表现为棕色颗粒状，差异均具有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。与模型组相比，SR Dex不同剂量组和阳性对照组均可抑制TRPC6的表达，差异均具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。

Fig 4 Effect of SR Dex on TRPC6 protein expression of renal tissues in safranine O-induced nephritic rabbits (IHC×200) n=4)A:control;B:Sham;C:model;D:Accessory;E-G:SR Dex 0.37,0.74,1.48 mg·kg-1;H:Dex 0.4 mg·kg-1.*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs model

2.6 SR Dex对藏红花红O肾病家兔肾组织中nephrin蛋白mRNA水平的影响如Fig5所示，与对照组相比，模型组、辅料组中nephrin蛋白mRNA的量显著下降，差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比，SR Dex不同剂量组和阳性药对照组nephrin蛋白mRNA的量均增加，差异均具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。

Fig 5 Effect of SR Dex on level of nephrin mRNA expression of renal tissues in safranine O-induced nephritic rabbits n=3)**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs model

2.7 SR Dex对藏红花红O肾病家兔肾组织中TRPC6蛋白mRNA水平的影响如Fig6所示，与对照组相比，模型组、辅料组中TRPC6 蛋白mRNA的量显著增多，差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比，SR Dex不同剂量组和阳性药对照组中TRPC6蛋白mRNA的量明显减少，差异均具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。

Fig 6 Effect of SR Dex on level of TRPC6 mRNA expression of renal tissues in safranine O-induced nephritic rabbits n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs model

3 讨论

本实验采用耳缘静脉注射臧红花红O的方法建立家兔肾病模型[11-12]，藏红花红O是一种有毒性的染料，其大量静脉注射可造成家兔肾小管上皮的坏死，这一作用与肾小球肾病的临床症状很像。此外，臧红花红O肾病模型还作为研究足细胞损伤检测的模型。本研究使用雄性家兔进行造模，造模成功率高。实验结果表明，在造模3 h后，家兔的尿液变成红色；在造模24 h后，家兔食欲不振，发生腹泻，尿蛋白量增加，血肌酐、尿素氮的量也明显增加。家兔肾组织病理结果显示，造模后出现肾小管上皮坏死，肾小球部分萎缩，伴随着炎性细胞的浸润等表现。本实验结果显示，SR Dex一次性肾囊植入可降低肾病家兔24 h尿蛋白的量。下调肾病家兔血肌酐和尿素氮的含量。同时肾脏病理组织学结果也显示，SR Dex各剂量组可不同程度的改善肾小球上皮细胞的增生、肾小球基底膜的增厚以及肾小球内脂类沉积。研究结果显示，SR Dex一次性肾囊植入对藏红花红O所致肾病家兔具有较好的保护作用。

值得注意的是，本实验结果显示用药前2周尿蛋白数值无明显降低，究其原因可能与以下因素有关。尿蛋白检测结果显示，肾病模型组在1-9周造模期间，尿蛋白一直在持续升高，与文献研究结果一致[11-12]，说明臧红花红O肾病模型随时间延续，损害逐渐加重。也就是说造模前2周处于疾病的上升阶段，不管是用药组还是模型组肾病家兔的尿蛋白都是升高的。而本研究受试药是缓释剂，Tab 1中2 w为用药1周时肾病家兔的尿蛋白量，此时药物的作用还未凸显。从结果数据来看，在用药两周后(Tab 1中3 w)开始发挥治疗作用，肾病家兔的尿蛋白开始下降，且随着用药时间逐步延长，尿蛋白数值逐渐下降，说明药物可以明显降低尿蛋白。总之，研究结果显示受试药可有效降低肾损指标，且维持时间较长。

足细胞位于肾小球上皮外层，胞体较大，呈多突状，又称足突。足突之间连接成裂孔隔膜，这些裂孔隔膜是保证肾小球正常滤过的屏障[13]。据文献报道，肾小球滤过系统的损伤后会产生大量蛋白尿，高蛋白尿的产生可能与足突之间裂孔隔膜的完整性受损有关。足突之间裂孔隔膜中nephrin、TRPC6蛋白表达与分布对稳定裂孔隔膜结构的完整性很重要。nephrin是首个被发现并已经证实的足细胞分泌蛋白[4]，位于19q13.1染色体上，其中NPHS1的突变会导致蛋白尿的产生[14]。TRPC6是在2005年被发现，因其与肾脏疾病之间的关系很快受到大家的关注。TRPC6位于裂孔隔膜，是裂孔隔膜相关蛋白，还是与蛋白尿有关的通道蛋白[15]，其主要功能为介导钙离子内流增多，并通过调控下游信号发挥功能。足细胞骨架结构蛋白的变化可能与TRPC6介导的钙内流相关。本结果显示，SR Dex可提高造模后nephrin的表达，降低TRPC6的表达，与类似文献研究一致[16-18]。所以对TRPC6通道的阻断或许会成为治疗肾脏疾病的新靶点。

综上所述，SR Dex肾囊内注射给药对藏红花红O肾病损伤具有很好保护作用，其作用机制可能与调节肾脏nephrin和TRPC6蛋白表达，增强足细胞滤过屏障功能有关。本实验结果为临床更有效的应用该类药物提供了实验基础。