山黧豆分子标记的开发及遗传多样性研究进展

严 昕 李孟伟 刘 荣 李 冠 王 栋季一山 王晨瑜 黄淑贤,2 宗绪晓 杨 涛

（1.中国农业科学院作物科学研究所 北京100081；2.黑龙江八一农垦大学生命科学与技术学院 大庆163319）

山黧豆（Lathyrus sativus L.），又名草香豌豆，是豆科蝶形花亚科山黧豆属下一个多用途的冷季豆栽培种。 由于其根系坚韧而有穿透力，可在干旱和洪水多发的环境和贫瘠的土壤中生长[1-2]。 除作为人类食品和动物饲料、绿肥作物外，山黧豆与根瘤菌共生，能使土壤中的氮素得到有效固定， 提高土壤肥力、降低作物轮作所需的投入， 使其成为轮作体系中的重要作物[3]。 由于山黧豆种子和植株中含有β-ODAP（β-N-草酰基-L-α,β-二氨基丙酸）， 作为谷氨酸类似物，在神经系统中与谷氨酸受体结合，可使神经元细胞受损或凋亡[4]。 长期大量食用山黧豆会引发特征性运动系统疾病[5]，具有食物中毒的潜在风险，使得其推广和利用受到限制。 分子标记作为辅助育种的工具，应用于遗传多样性研究、遗传图谱构建、重要基因的定位起源与进化关系的阐述等。 由于山黧豆的发展较其他作物落后，关于山黧豆DNA 水平的研究较少， 因此笔者对近几十年来关于山黧豆属分子标记的开发及遗传多样性等研究进展进行概述，并针对其未来的研究方向提出建议。

1 山黧豆种质资源研究概况

1.1 山黧豆的起源与分布

山黧豆的遗迹最早于公元前3 000 多年前在印度和西亚发现[6]。 有关山黧豆的实际起源不详，目前，一般认为山黧豆起源于南欧和西亚， 后来扩展到地中海地区[7]。 山黧豆的物种多样性分布在欧洲、亚洲和北美洲，并延伸到南美洲和东非，但多样性的主要中心仍然主要在地中海和伊朗—土耳其地区[8]，地中海地区的栽培山黧豆具有高产、粒大等特点，种质优异。 山黧豆属分布范围广泛（表1），包括中东、中欧、东欧、南欧和南美部分地区，埃及和阿尔及利亚也有栽培，但规模比较小。 在中国的西北和华北地区，比如甘肃、山西、陕北、内蒙古等也有山黧豆的种植。

表1 山黧豆属的分类与分布

1.2 山黧豆收集、保存

中国自建国以来， 开始收集和引进山黧豆种质资源，培育山黧豆品种，截至2018 年，国家种质库共收集引进山黧豆属种质资源476 份， 涉及地方资源和野生近缘种， 其中国内收集的地方资源有36 份。山黧豆因其具有经济价值和生态价值， 各国展开不同程度的种质资源收集与保存工作， 一些重要的山黧豆属种质资源已经收集起来， 并在世界各地的一些不同研究所异地保存。 法国国家植物保护机构（CBNPMP）（4 477 份） 和叙利亚国际植物保护机构（ICARDA）（3 239 份）保存了数量最多的山黧豆属品种，约占 50%（表 2）。

表2 山黧豆属主要种质资源的收集

1.3 种质资源研究利用

山黧豆为一年生草本植物， 可以在恶劣的环境条件下生存。 强大而穿透力强的根系使其能够在多种土壤类型中生长， 包括非常贫瘠的土壤和黏土[11]，而其利用残留水和土壤养分的能力使该物种适应了低投入或零投入。 此外， 它能与豆科根瘤菌有效结瘤，使土壤富含氮，可用于之后的农作物[12]。李屹峰等以金燕18 号燕麦为试验作物，在晋西北进行了2 年的大田施氮试验，结果表明，山黧豆田间留茬能提高土壤氮含量和燕麦籽粒产量[13]。况胜剑等提出山黧豆用于培肥土壤及提升景观效应的最适种植密度应分别为 30 kg/hm2和 45 kg/hm2[14]。因此，在干旱地区，当农田不能施以有机肥时，山黧豆可留田作为绿肥间、套种植继续给作物供给营养[15]。山黧豆在饲料喂养实践中， 最早喂食的是茎叶部分， 其蛋白质含量达到18.82%～20.14%，粗蛋白含量与苜蓿含量相差很小[16]，在我国西北地区山黧豆可作为潜在的饲料资源。 与其他豆类相比，山黧豆对许多害虫（包括贮藏昆虫）的抵抗力也更好。 由于山黧豆耐旱、耐涝、耐瘠薄、产量稳定、品质性状好，可以作为牧草、绿肥或饲食多功能作物，具有较高的社会经济价值。

2 山黧豆分子标记开发研究进展

目前，DNA 分子标记技术发展迅猛，广泛应用于分子标记辅助育种、 遗传连锁图谱构建、QTL 定位、图位克隆等方面[17]。 分子标记是DNA 水平遗传多态性的直接反映，是对形态学表征的有效补充，因为它们是高效的， 不受植物组织或环境影响， 并且可以在作物或牧草发育的早期进行品种真实性鉴定[18]。迄今为止，一些分子标记如AFLPs（Amplified Fragment Length Polymorphisms， 扩 增 片 段 长 度 多 态 性 ）[19]、RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性 DNA）[20]和 RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性）[21]、ISSR（Inter Simple Sequence Repeat，简单序列间重复）[22]等已被成功地用于研究Lathyrus 属内的遗传变异或种间关系。RAPD 是通常为10 个碱基的标记，具有较广的共通性，合成的一套引物能用于不同的物种。 RFLP 技术鉴定物种的多态性不受环境条件和发育阶段的影响，在等位基因与非等位基因上能产生不同的效应，因而互不干扰。 SSR 标记是遗传多样性研究中常用的、信息量大的分子标记，到目前为止，利用SSR 标记对山黧豆属遗传多样性的研究还很少。 近年来，在全基因组高通量测序技术的推动下， 分子标记开发数量呈指数级增加。 第 3 代 DNA 遗传标记 SNP（Single Nucleotide Polymorphism， 单核苷酸多态性）标记具有密度高、遗传稳定的特点，而且几乎都以二等位多态性存在， 检测时无需对片段的长度作出测量，极易实现自动化，可帮助区分2 个个体遗传物质的差异， 除了SNP， 第3 代分子标记还包括 KASP、InDel 等。 开发和利用分子标记进行DNA 多态性的检测和利用，是分子遗传学领域最重要的发展之一。它们以其更准确、更方便、更快捷的方法弥补了田间形态学鉴定和生化标记鉴定方法的不足。

据资料统计，Lioi 等[23]搜索EMBL 核苷酸序列数据库中可用的山黧豆属DNA 序列，得到了20 对SSR引物， 利用在意大利收集的地方品种， 结合农艺性状，筛选出6 对具有多态性的分子标记。 Sun 等[24]通过筛选美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库鉴定了300 对EST-SSR 引物， 并对来自世界各地的24 份山黧豆种质资源进行验证，其中44 对EST-SSR标记具有多态性。 Shiferaw 等[25]利用来自相关物种标记的跨物种转移能力开发了来自模型物种蒺藜苜蓿的 19 对 EST-SSR 和 NCBI 数据库中的山黧豆属EST 序列，并验证了多态性标记，在各地区中，Gojam、Gonder、Shewa 和 Welo 地区的多样性水平较高，其中Gonder 地区的不同等位基因数量较多， 成功用于探索埃塞俄比亚草豌豆种质的遗传多样性。 Yang 等[26]利用454 FLX 钛热测序技术设计了50 144 对非冗余引物对，并随机选择288 对引物对24 份山黧豆材料进行扩增反应，共筛选出74 对多态性引物。 Almeida等[27]评价了蒺藜苜蓿、豌豆、扁豆、和蚕豆的分子标记对山黧豆的转移能力， 并对这些分子标记在山黧豆属中定位和多样性研究中的应用进行了试验， 他们采用RNA-Seq 技术开发200 个EST-SSR 标记。在这些标志物中，40 个标记在 2 份材料间具有 25 个（62.5%）多态性。 Hao 等[28]利用 RNA 转录组测序设计了3 204 个EST-SSR 引物，随机选择了284 个 ESTSSR 引物进行验证。 在这些经过验证的单基因中，有87 种（30.6%）EST-SSR 引物在选自不同地理位置的43 种豌豆种质中产生了多态性扩增子。同时，筛选了146 406 个 SNP， 随机选择了 50 个 SNP 位点进行竞争性等位基因特异性PCR（KASP）验证。 超过 80%（42）SNP 位点已成功转化为 KASP 标记。 Soren 等[29]使用CD-HIT 软件对从国家生物技术信息中心（NCBI） 数据库中检索到草豌豆转录组组合进行检测，并筛选出152 对SSR 引物，其中60 个具有多态性，并将来自7 个国家的50 份山黧豆属材料分为4 个亚群。

3 山黧豆遗传多样性研究进展

遗传多样性是物种长期进化的产物， 是适应环境变化的前提。 遗传多样性越高，其遗传或者变异越大，对恶劣环境条件表现出的适应能力较强，物种发生基因突变或者染色体变异的植株生存下来的可能性较大，从而提高了物种内的多样性和基因频率，为育种提供了可能性和重要的资源。 此外，遗传多样性的研究也揭示了物种的起源和种内亲缘关系， 研究种质资源的遗产多样性， 能为分析其进化和未来的发展提供重要的资料[30]。

山黧豆是自花授粉作物， 通过前人对山黧豆杂交发现，该物种花色、花的形状与组成、籽粒大小等性状能稳定遗传，比如，来自欧洲和北非的白色种子较大， 而来自亚洲和埃塞俄比亚的有色种子相对较小[31]。因此不同地理位置和不同起源的山黧豆品种在这些性状上有明显差异， 也能根据这些性状将山黧豆进行分群分类。Jackson 和Yunus[32]利用花的颜色和籽粒大小等性状采用主成分分析和聚类分析对49份山黧豆种质资源进行了形态学变异研究分析，并对14 种山黧豆属植物进行了变异评价，山黧豆属作物显示出巨大的形态学变异， 特别是在植被特征如叶长方面，而花的特征则变化较少。 这一系列的变异无疑是地理分离及人类选择的结果。

此外，通过DNA 分子标记或者结合形态分析对山黧豆属进行遗传多样性分析。 Barik 等[20]利用RAPD标记评估了所选山黧豆基因型之间的遗传变异性，对优良基因型进行了鉴定， 揭示了它们之间的亲缘关系。 RAPD 标记扩增出来的DNA 多态性也可被整合到标记辅助选择和育种计划中，能对这种重要营养作物物种进行遗传改良。 Wang 等[33]利用30 个SSR位点分析了非洲、欧洲、亚洲和伊卡达地区野生和驯化群体283 个个体的遗传多样性和群体结构。 基于模型的种群结构分析将种质资源划分为3 个亚群：近缘种、亚洲种、欧洲和非洲种。AMOVA 分析结果表明，栽培种与其近缘种差异较大，但其地理来源分化程度较低。 这些结果为了解山黧豆属及其近缘种的遗传多样性提供了分子基础。 Gupta 等[34]利用 18 对EST-SSR 标记将一组来自孟加拉国的100 种豌豆种质与18 种野生山黧豆属种质进行了表征遗传多样性，通过聚类分析分成4 个主要类群，且第一类群由20 个具有高β-ODAP 浓度的材料组成， 其中17 种是野生的。 Kumari 等[35]使用 20 个 SSR 标记对 32 个山黧豆栽培品种进行了分子遗传多样性研究，有11 个标记被证明是多态性的，可以检测到总共 21 个等位基因，揭示了29%的遗传多样性，通过邻接UPGMA聚类分析的树枝图，将基因型分为3 个主要聚类。

目前，由于农业集约化、过度放牧、永久牧场减少，山黧豆属的遗传多样性经历了严重的遗传侵蚀。就地保护和异地保护对山黧豆属种质资源评价、保护物种多样性、 降低遗传冲刷和种质资源利用有不同程度的作用。 另外，随着环境不同程度的恶化，各部门急需展开山黧豆属搜寻和保护工作， 有效地应对粮食安全和气候变化对作物产量的影响。

4 结语

植物遗传资源保护， 对于满足当前和未来作物改良需要至关重要。 然而， 由于现有的资源很少，评估工作仅限于几个分散的种质收集中， 再加上目前的分子和生物技术育种工具有限， 山黧豆属育种进展缓慢。 因此， 对于未被充分利用却很有前途的山黧豆， 需要更有效、 更快速的育种方法。 山黧豆是一种可以在恶劣天气条件下生存的作物， 因此可以作为困难时期生存的备用食品。 山黧豆虽是一种很有益的作物，但很少有人关注[36]，至于DNA 水平的研究就更少， 因此需要对其种质资源进行全面收集和广泛的鉴定评价。 未来山黧豆研究， 应考虑将工作重心放在高质量的基因功能开发， 配合基因编辑技术， 挖掘重要的功能基因和特有的遗传变异， 发挥山黧豆属在产量和应对恶劣环境等方面的巨大潜力。 关于山黧豆新品种培育，研究者致力于选育低含量β-ODAP 或无毒的山黧豆， 对山黧豆种子产量与其构成因素的关系及其他重要性状的研究报道相对较少，应考虑对山黛豆种子进行综合研究开发。 为了实现有效的保护并增加种质资源的利用， 需要对现有栽培资源的多样性进行详细描述。 山黧豆种质多样性水平不同的信息， 将有助于拓宽育种亲本的遗传背景， 并有助于寻找现代育种中尚未开发的基因和等位基因。