慢病毒介导短发夹RNA干扰技术建立小鼠肺组织TRIF沉默模型▲

谢 军 龙晓茹 任 洛 刘恩梅 谢晓虹

(1 重庆医科大学附属儿童医院两江呼吸科，2 儿童发育疾病研究教育部重点实验室、国家儿童健康与疾病临床医学研究中心、儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地、儿科学重庆市重点实验室，重庆市 400014，电子邮箱：cyxiejun@126.com；3 重庆医科大学附属儿童医院两江感染科，重庆市 400014)

β干扰素Toll/白细胞介素1受体结构域衔接蛋白(Toll/interleukin 1 receptor domain containing adaptor inducing interferon-β，TRIF)是含TIR结构域接头蛋白家族中最长的分子，含712个氨基酸，也是Toll受体(Toll-like receptor，TLR)家族中TLR3、TLR4信号通路关键的衔接分子，参与天然免疫和适应性免疫，在抗病毒感染中有重要作用[1]。研究表明，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染可活化TRIF，介导γ-干扰素高表达,从而参与气道炎症和气道高反应，而非特异性抑制TRIF可减轻RSV引起的气道炎症和高反应性[2-3]。为了更好地探讨TRIF信号通路在病毒感染，尤其是在RSV感染中的作用，建立一个局部TRIF低表达动物模型十分必要，而目前尚没有肺组织局部沉默TRIF的小鼠模型。本研究旨在采用一种简便且无创的慢病毒介导短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)干扰技术建立BALB/c小鼠局部肺组织TRIF低表达模型，探讨TRIF在RSV感染中的作用及其潜在的价值。

1 材料与方法

1.1 TRIF慢病毒载体的构建 本实验中所用的shRNA慢病毒载体由上海吉凯基因有限公司提供。事先已设计并合成4条针对TRIF的shRNA干扰质粒，并采用小鼠巨噬细胞系RAW246.7筛选出沉默效果最优的干扰序列，然后进行载体的构建和慢病毒包装。TRIF-shRNA序列5′-GGACCACTCAGAAACATCT-3′，对照CON-shRNA序列5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。质粒载体信息：GV115载体，原件顺序hU6-MCS-CMV-EGFP。

1.2 实验动物及模型的建立 无特定病原体级6～8周龄雌性Balb/c小鼠18只，由重庆医科大学实验动物中心提供[动物合格证号：SYXK(渝)2018-003],饲养于ⅣC级环境中，饲料、饮用水均经过严格消毒灭菌，实验操作过程均按照重庆医科大学伦理委员会要求进行[SCXK(渝) 2012-0001以及SYXK(渝) 2012-0001]。采用随机数字表法将Balb/c小鼠分为空白组、实验组、对照组，每组6只。采用水合氯醛0.3 mL/kg腹腔注射麻醉小鼠，待麻醉成功后将50 μL滴度为1×108TU/mL的病毒液(病毒滴度的设置参考文献[4])经鼻滴注：提起小鼠双耳及头颈部皮肤，使其完全竖直，将含TRIF-shRNA(实验组)或对照慢病毒载体(对照组)的病毒液25 μL 经一侧鼻孔快速滴入(时间在10 s内)，导入小鼠肺组织内，然后用丝线钩住小鼠牙齿，悬挂小鼠使其身体竖直约3 min后再于另一侧鼻孔滴入25 μL病毒液(时间在10 s内)，空白组按照上述方法经两侧鼻孔分别滴入磷酸缓冲盐溶液25 μL。所有操作均在生物安全柜中进行，滴鼻后小鼠仍饲养于ⅣC级环境中，第8天处死小鼠后收集其肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、心脏组织。

1.3 肺组织冰冻切片 脱颈处死小鼠后，取出肺组织，于4%多聚甲醛中固定24 h，30%蔗糖脱水24 h，于-20℃冰冻切片机内包埋、切片，连续10 μm切薄片并予载玻片附贴组织切片，室温下避光放置30 min后，磷酸缓冲盐溶液清洗3次，使用5 mg/mL的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI；碧云天公司，批号：C1005)在室温下行细胞核染色30 min后，磷酸缓冲盐溶液清洗3次后干燥封片，于荧光显微镜(日本Olympus公司,BX53)下观察肺组织绿色荧光蛋白表达情况。

1.4 定量PCR检测TRIF表达水平 根据RNA提取试剂盒(TaKaRa公司，RNAiso Plus，批号：9108)说明书提取肺脏、肝脏、脾脏、心脏、肾脏组织总RNA，紫外分光光度计定量后，根据反转录试剂盒(TaKaRa Clontech公司，批号：639547)说明书取2 μg RNA 37℃反转录15 min，85℃反转录5 s。采用TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems公司，批号：4304437)检测TRIF表达水平，反应体系包括Mix 10 μL、上游引物 0.3 μL、下游引物 0.3 μL、cDNA 2 μL、超纯水7.4 μL。反应步骤：50℃ 2 min;95℃ 10 min;95℃ 15 s;60℃ 1 min， 40个循环。PCR仪购自Bio-Rad公司(型号：CFX960 Touch)。TRIF及内参β-肌动蛋白(β-actin)引物均由华大基因合成，引物序列见表1。采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.5 蛋白质印迹法检测肺组织TRIF蛋白表达 按照全蛋白提取试剂盒(美国Active Motif公司，批号：40010)操作说明提取肺组织总蛋白，按照蛋白定量试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：KGP902)操作说明，采用二喹啉甲酸法定量蛋白。80 μg总蛋白上样，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶经过电泳、转膜、封闭，一抗TRIF(Abcam公司，批号：ab13810；稀释比例1 ∶20 000)、β-actin(康为世纪生物科技有限公司，批号：CW0096M；稀释比例1 ∶10 000)4 ℃孵育过夜，经洗膜后二抗(杭州联科生物技术有限公司，批号：GAR0072；稀释比例1 ∶10 000)室温孵育1 h，随后采用ECL化学发光液(Bio-Rad公司，批号：1705062)检测蛋白信号并通过Quantity One 软件 (Bio-Rad公司) 进行蛋白定量分析。

1.6 统计学分析 采用GraphPad Prism 5.03软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肺组织中绿色荧光蛋白的表达 转染后实验组肺组织可见明显绿色荧光蛋白表达，见图1，蓝色DAPI表示细胞核，绿色EGFP代表绿色荧光蛋白。

2.2 各组小鼠肺组织中TRIF mRNA和蛋白相对表达水平 实验组小鼠肺组织中TRIF的mRNA和蛋白相对表达水平均低于空白组与对照组(均P<0.05)，而空白组与对照组之间差异无统计学意义(均P>0.05)，见表1和图2。

图2 3组小鼠肺组织中TRIF蛋白的表达情况

1.4 各组小鼠肝脏、脾脏等其他组织中TRIF的表达情况 为了解经鼻滴入法转染慢病毒干扰载体是否会影响其他组织TRIF表达，同时检测了肝脏、脾脏、肾脏、心脏组织中TRIF基因表达水平情况。3组小鼠不同组织中TRIF mRNA相对表达水平差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表2。

表2 3组小鼠不同组织中TRIF mRNA相对表达水平的比较(x±s)

3 讨 论

RNA干扰是近些年发展起来的转录后基因沉默技术，可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异地阻断体内特定基因表达，目前已广泛应用于医学领域的研究[5]。而慢病毒载体可以将外源基因或外源shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果[6]。应用慢病毒载体沉默基因，不仅具有特异性高、操作简单等优点，还可节约成本、周期更短[7-8]。本研究通过采用一种简便易行的方法成功建立了小鼠肺组织TRIF沉默模型，有助于更好地研究TRIF在病毒感染中的作用，尤其是在RSV感染后病理生理中的角色。

本研究采用轻微麻醉、经滴鼻方式将慢病毒液转入肺部，从而沉默肺组织中TRIF表达。课题组已经具有经滴鼻方式转入RSV或质粒进入肺组织的丰富经验，从而成功建立了RSV感染不同类型小鼠模型及干扰肺部基因动物模型[9-10]。本研究通过滴鼻方式将慢病毒转染至肺部，免疫荧光检测结果提示肺组织中存在明显绿色荧光蛋白表达，这表明慢病毒确已转入肺组织中并成功表达。而实验组肺组织中TRIF的基因及蛋白表达均降低，证实有效TRIF沉默，提示建立成功模型。肺部shRNA给药有多种方式，包括静脉给药、气管给药、经鼻给药以及雾化给药等方式[11]。各种方式均具有各自的优点，相对于静脉给药，局部给药直达肺部所需剂量更少，系统副作用更小，且能够增强沉默效果[12]。本研究采用经鼻给药建立模型，操作简单、损伤小，不需要气道插管、对气道创伤小，成功率高，小鼠死亡率低，且病毒液使用量少，沉默效果显著。而通过检测肝脏、肾脏、心脏等组织中TRIF的表达情况，发现局部给予TRIF沉默慢病毒载体，并不影响肺外组织TRIF的表达，因而特异性高，能更好地模拟局部基因表达缺陷对病毒感染尤其是RSV感染的影响。

总之，本研究采用慢病毒载体介导的shRNA干扰技术成功构建了小鼠局部肺组织TRIF沉默模型，该方法操作简单，病毒滴度容易获得，这为研究TRIF在病毒感染中的作用提供了有效的方式。