艾草抑菌抗炎作用研究

陈文东

(陇南师范高等专科学校农林技术学院，甘肃，成县 742500 ）

艾草（Artemisia Argyi）又名艾蒿，为半灌木状菊科蒿属，多年生草本植物[1]。别名萧茅、冰台、艾绒等，茎褐色或灰黄褐色，全草入药，它是一种具有药用和食用价值的多功能植物，药源丰富，毒性较低，具有广泛的开发利用价值[2]。药理学研究发现，艾草具有温经、祛湿、抗过敏、散寒、平喘、消炎、止咳、止血、安胎等作用[3-4]。

腹泻是动物养殖业中最常见的一种胃肠道疾病，如果不能及时的治疗，会引起动物生长速度减慢、产蛋率下降等，严重时可引起动物死亡，给养殖业带来巨大的经济损失。引起动物腹泻的致病菌主要为大肠杆菌，对幼畜禽危害最为严重。目前，临床上主要使用抗生素进行治疗腹泻，在取得一定治疗效果的同时也带来了细菌耐药性、兽药残留和病情易复发等问题。因此，本研究以艾草为研究对象，初步探讨艾草水煎液的抑菌抗炎作用，以期为研究和开发高效、低毒、低残留的纯中药制剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药物、菌种和培养基

艾草（采自陇南师专梁山校区）、阿司匹林（拜耳医药）、速眠新（拜特）、大肠杆菌（由本实验室从陇南机场受伤的灰鹤粪便内分离鉴定）、肉汤培养基、普通琼脂培养基、麦康凯培养基和血琼脂平板（按微生物教材配制）。

1.2 试剂和仪器

伊文斯兰（Evans Blue，博美）、二甲苯（隆昌）、无水乙醇（富宇）、乙酸（河南化工研究所）、旋转蒸发仪（ZFY-2L，科兴）、分光光度计（SP-723 PC，光谱）、分析天平（FA2004N，上海精密科学仪器）、电热式压力蒸汽灭菌器（XFH-50MA，新丰）、鼓风干燥箱（NJ101-4A，天泰）、粉碎机（32000 r/min，铂欧）。

1.3 实验动物

昆明系小白鼠，雌雄各半，体重30～35 g（购自兰州兽医研究所）。

1.4 试验方法

1.4.1 艾草水煎液制备[5]

用粉碎机将晒干后的50 g 艾草粉成粉末状，加蒸馏水500 mL，充分混匀，浸泡30 min 后用电炉煮沸，煮沸后改用温火煎30 min，用八层纱布过滤，如此反复煎煮两次。合并两次滤液分装于15 mL 离心管内1500 r/min 离心5 min，去掉底层沉渣，将水煎液浓缩至50 mL（含药量1.0 g/mL），121 ℃条件下高压蒸汽灭菌半小时，密封，置于4℃冰箱保存备用。

1.4.2 体外抑菌作用

1.4.2.1 细菌悬液制备

超净台内无菌操作，将9 支试管分别加入9 mL无菌生理盐水，用记号笔依次标记为1～9。在1 号试管内加入1.0 mL 菌液，吹打均匀，再从1 号试管内吸取1.0 mL 混合后的菌液至2 号试管内，以此类推，直至9 号试管。

取20 个普通琼脂平板，平均分成5 组，分别标记5、6、7、8、9，将5～9 号试管内的菌液分别加入对应的平板内，每个平板加100 μL，用涂布棒把菌液涂均匀，37℃培养24 h，计数。将菌液浓度调整为5×106CFU/mL。置于4℃冰箱备用。

1.4.2.2 试管二倍稀释法

超净台内无菌操作，取10 支无菌试管，编号1～10，每支编号试管重复5 次，在前9 支试管中分别加入2 mL 普通肉汤培养基，再在1 号试管中加艾草水煎液2 m L，吹打均匀，从1 号试管中吸出2 mL 加到2 号试管中，按此稀释药液至8 号试管。9 号试管为阳性对照，不加药液，10号试管为阴性对照，只加入2 m L 艾草水煎液。在上述1～9 号试管内各加100 μL细菌悬液，10 号试管内加100 μL生理盐水，振荡器上混合均匀，37℃培养24 h，观察各试管浑浊状态并记录结果。

结果判定：在阳性对照试管呈浑浊状，阴性对照试管呈透明状的前提下，观察其余试管内细菌生长情况，以不变浑浊的最低药液浓度作为艾草水煎液的MIC，从确定MIC 的试管内吸取培养液，涂布于普通琼脂平板上，37℃培养24 h，观察平板内细菌生长情况并计数。结果判定：琼脂平板内菌落数不超过5 个的最低浓度为艾草水煎液的MBC。

1.4.2.3 牛津杯法

超净台内无菌操作，在普通琼脂平板上加100 μL菌液，涂布棒涂均匀。在平板内均匀放置4 个牛津杯，牛津杯中分别加入250 μL不同浓度的艾草水煎液，浓度分别为1、0.5、0.25、0.125 g/mL，每个药液浓度重复4 次。于4℃冰箱放置半小时，再放入37℃培养箱内培养24 h，游标卡尺测定抑菌圈大小，并以抑菌圈大小和有无来评价药物抑菌活性。

效果判定：直径：≥20 mm，极敏感；20 mm＞直径≥15 mm，高度敏感；15 mm＞直径≥10 mm，中度敏感；直径＜10 mm，低敏感或无效。

1.4.3 抗炎作用

1.4.3.1 乙酸致小白鼠毛细血管通透性试验[6]

将50 只小白鼠平均分成5 组，各组内小白鼠雌雄各半，禁食24 h 后，开始灌服艾草水煎液，每日1 次，连续7 d。第一组为艾草水煎液高浓度组（0.2 g/mL），第2 组为艾草水煎液中浓度组（0.1 g/mL），第三组为艾草水煎液低浓度组（0.05 g/mL），第四组为阳性对照组（阿司匹林，0.001 g/mL），第五组为空白对照组（生理盐水），每组灌药量为10 mL/kg。第7 d 灌药12 h 后，在小白鼠尾静脉注射伊文斯兰水溶液（1 g/L），注射量为0.1 mL/10 g，然后小白鼠腹腔注射冰乙酸溶液致炎，30 min 后将小白鼠断颈处死，再在腹腔内注射生理盐水5 mL，按摩小白鼠腹部数分钟后，解剖小白鼠，吸取腹腔内液体到离心管中，3000 r/min 离心10 min，收取上清液，在590 nm 波长下测定OD 值，用OD 值表示小白鼠毛细血管渗出伊文斯兰的量，记录数据并计算毛细血管通透性抑制率。

计算方法：通透性抑制率＝（空白组平均OD值－药物组平均OD 值）/空白组平均OD 值×100%。

1.4.3.2 二甲苯致小白鼠耳肿胀试验[6-7]

小白鼠分组及灌药方法同1.4.3.1 方法，第7d灌药12 h 后，在每只小白鼠的左耳廓滴涂二甲苯致炎，右耳作空白对照，30 min 后将小白鼠断颈处死，接着用打孔器在左、右耳廓对称位置打下耳片，电子分析天平称重，记录数据并计算耳肿胀抑制率和肿胀度。

计算方法：耳肿胀度=左耳片质量-右耳片质量；肿胀抑制率=（空白组平均肿胀度-药物组平均肿胀度）/空白组平均肿胀度×100%。

1.4.3.3 小白鼠棉球肉芽肿试验[6]

小白鼠分组同1.4.3.1 方法。肌肉注射麻醉小白鼠，在小白鼠腹股沟皮下埋植无菌脱脂棉球。手术24 h 后开始给小白鼠灌服药液，灌药方法同1.4.3.1。第7 d 灌药12 h 后，将小白鼠断颈处死，分离出腹股沟处的脱脂棉球，在60℃干燥箱内烘干至恒重，记录数据并计算肉芽肿质量和增生抑制率。

计算方法：肉芽肿质量=棉球肉芽肿质量-原棉球质量；增生抑制率=（空白组肉芽肿平均质量-药物组肉芽肿平均质量）/空白组肉芽肿平均质量×100%。

1.5 统计学分析

运用SPSS18.0 对数据进行分析，数据用“平均数±标准差(x ±SE)”表示；用单因子方差分析(One-way ANOVA,LSD)进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 体外抑菌作用

四个浓度的艾草水煎液作用于大肠杆菌。结果表明，1.0、0.5、0.25 g/mL 的艾草水煎液对大肠杆菌具有一定的抑制作用，且浓度越高，抑菌效果越好。1.0 g/mL 艾草水煎液的抑菌直径大于15 mm，为高度敏感；0.5 g/mL 艾草水煎液的抑菌直径大于10 mm，为中度敏感；0.25、0.125 g/mL 艾草水煎液的抑菌直径小于10 mm，为低度敏感（表1）。艾草水煎液对致病型大肠杆菌的MIC 为0.125 g/mL，MBC 为0.25 g/mL，表明艾草对致病型大肠杆菌具有一定的抑菌和杀菌作用（表2）。

表1 艾草的抑菌直径（mm）Table 1 The inhibition zone diameter of Artemisia Argyi

表2 艾草的MBC 和MIC（g/mL）Table 2 The MBC and MIC inhibition of Artemisia Argyi

2.2 抗炎作用

艾草水煎液对小白鼠毛细血管通透性的影响结果见表3；艾草水煎液对二甲苯致小白鼠耳肿胀的影响的结果见表4；艾草水煎液对小白鼠棉球肉芽肿的影响结果见表5。

由表3 可见，艾草对乙酸致小白鼠毛细血管通透性升高有一定抑制作用, 高、中、低浓度和阳性对照组对毛细血管通透性升高抑制率分别为29.11%、27.14%、16.61%和50.89%。艾草水煎液高、中浓度和阳性对照组与空白对照组相比，存在极显著性差异(P<0.01)；艾草水煎液低浓度组与空白对照组相比存在显著性差异 (P<0.05) 。不同药液浓度比,艾草水煎液高浓度组和中浓度组间差异不显著，高浓度组与阳性对照组存在极显著性差异(P<0.01)；艾草水煎液中浓度组与低浓度组间存在显著性差异(P<0.05)，与阳性对照组之间也存在极显著性差异(P<0.01)；艾草水煎液低浓度组与阳性对照组间存在极显著性差异(P<0.01) ，与高浓度组和中浓度组相比存在显著性差异(P<0.05) 。

表3 艾草对小白鼠毛细血管通透性的影响Table 3 Effect of Artemisia Argyi on capillary permeability of abdominal cavity in mice

表4 结果显示，艾草水煎液对二甲苯所致小白鼠耳肿胀有一定的抑制作用, 高、中、低浓度和阳性对照组耳肿胀抑制率分别为25.045%、21.779%、5.082%和31.760%。艾草水煎液高、中浓度和阳性对照组与空白对照组相比存在极显著性差异（P<0.01），艾草水煎液低浓度组与空白对照组相比存在显著性差异（P<0.05）；不同药液浓度比，艾草水煎液高浓度组和中浓度组间差异不显著，阳性对照组与高浓度组和中浓度组间存在极显著性差异（P<0.01）；艾草水煎液低浓度组与高、中浓度组和阳性对照组相比存在极显著性差异（P<0.01）。

表4 艾草对小白鼠耳肿胀的影响Table 4 Effect of Artemisia Argyi on ear swelling in mice

由表5 可见，艾草水煎液对小白鼠棉球肉芽肿增生有一定的抑制作用，高、中和低浓度组小白鼠肉芽肿增生抑制率分别为19.990%、9.101%和2.611%，阿司匹林对小白鼠棉球肉芽肿增生有明显的抑制作用，小白鼠棉球肉芽肿增生抑制率为49.332%。艾草水煎液高、中浓度和阳性对照组与空白对照组相比存在极显著性差异（P<0.01）；艾草水煎液低浓度组与空白对照组相比也存在显著性差异（P<0.05）。不同药液浓度比, 艾草水煎液高、中浓度组、阳性对照组相比存在极显著性差异（P<0.01）；艾草水煎液低浓度组与高浓度组和阳性对照组相比较存在极显著性差异（P<0.01）；与中浓度组相比也存在显著性差异（P<0.05）。

表5 艾草对小白鼠棉球肉芽肿的影响Table 5 Effect of Artemisia Argyi on granuloma of cotton ball in mice

3 讨论

以分离鉴定的致灰鹤腹泻大肠杆菌为对象，用试管二倍稀释法和牛津杯法检测艾草水煎液对大肠杆菌的MIC、MBC 和抑菌活性。结果表明, 艾草水煎液对引起灰鹤腹泻的大肠杆菌有一定的抑制生长作用，且抗炎效果随着药物浓度的增加而增加。艾草水煎液对大肠杆菌的MIC 和MBC 分别为0.125、0.25、1.0 g/L艾草水煎液抑菌圈直径为16.622 mm，高度敏感；0.5 g/mL 艾草水煎液抑菌圈直径为11.841、中度敏感；0.25 g/mL 艾草水煎液抑菌圈直径为9.420 mm，0.125 g/mL 艾草水煎液无抑菌圈，低敏感或无效。

通过乙酸致小白鼠毛细血管通透性试验、二甲苯致小白鼠耳肿胀试验和小白鼠棉球肉芽肿增生试验来测定艾草抗炎作用，分别测定通透性抑制率、小白鼠耳肿胀抑制率和棉球肉芽肿增生抑制率，评价艾草的抗炎效果。结果表明，艾草对三种验证模型均有抑制作用，且抗炎作用随着艾草水煎液浓度的增大而增强。艾草水煎液高浓度组（2 g/kg）毛细血管通透性抑制率为29.107%，小白鼠耳肿胀抑制率25.045%，小白鼠棉球肉芽肿增生抑制率为19.990%，与空白对照组和阳性对照组相比存在极显著性差异（P<0.01），表明艾草有一定的抗炎作用，但抗炎效果不如阿司匹林。

中国为抗生素生产和使用大国[8]，当前抗生素残留和致病菌耐药性问题日益严重，其中畜禽养殖是环境中抗生素残留的主要来源[9-10]，严重危害人类健康和养殖业健康发展；2020 年1 月1 日，我国实施“退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种”的最严“禁抗、限抗、无抗”政策[11]。因此，寻找一种无副作用、无毒、无残留且高效的中草药成为当前热门研究。本研究以天然中草药艾草为研究对象，初步探讨其抑菌抗炎作用，以期为畜牧养殖业健康发展、促进动物绿色健康生产、解决因抗生素残留而导致的动物产品安全问题提供理论依据。