QuEChERS-气相色谱-串联质谱法测定果蔬中乙烯菌核利及其代谢物的残留量

谢建军，侯颖烨，曾广丰，王璐，李菊

（广州海关技术中心，广东广州 510623）

乙烯菌核利（vinclozolin）是一种广谱、保护性和触杀型杀菌剂，广泛应用于防治水果、蔬菜上的真菌病害。但是，动物毒理实验表明乙烯菌核利是一种环境抗雄激素，能够导致雄性生殖器官异常或雄性雌性化，其中存在威胁人体健康主要是其代谢物3,5-二氯苯胺（3,5-dichloroaniline）[1-5]。

GB 2763《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中对乙烯菌核利的最大残留限量（MRL）有明确规定，且均是以乙烯菌核利和其代谢物3,5-二氯苯胺的总和计算[6]。目前，蔬菜和水果可参照NY/T 761《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》方法测定，谷粮参照GB 23200.9《食品安全国家标准粮谷中475种农药及相关化学品残留量测定气相色谱-质谱法》方法测定[7,8]。这两个标准都是多农残检测方法，有机溶剂用量多，前处理复杂，耗时长；且标准中没有建立3,5-二氯苯胺的检测方法。国内外也有部分文献报道使用气相色谱仪[9-11]、气相色谱-质谱联用仪[12,13]、液相色谱仪[14-17]测定植物源性食品中乙烯菌核利残留量；但这些文献报道中均未对乙烯菌核利的代谢物3,5-二氯苯胺残留量检测进行研究[9-14]。

因此，本文在QuEChERS 方法的基础上[18,19]，通过对2 种提取溶剂和5 种净化吸附剂筛选，确定了乙酸乙酯提取，PSA 粉80 mg、GCB 粉50 mg 组合吸附剂净化，建立了同时检测水果蔬菜中乙烯菌核利及其代谢物 3,5-二氯苯胺残留的气相色谱/质谱（GC/MS）检测方法。该方法的前处理简便、快速、便捷，可满足果蔬中乙烯菌核利和3,5-二氯苯胺的定性和定量检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 7890A 气相色谱仪、5973C 质谱仪，美国Agilent 公司；IKA MS 3 basic 涡旋振荡器，德国IKA 公司；Turbovap LV 氮气吹干浓缩仪，美国Zymark 公司；Heidolph promax 2020 水平振荡仪，德国Heidolph 公司；台式离心机，德国Sigma 公司；Milli-Q 超纯水仪，美国Millipore 公司。

乙腈和乙酸乙酯为色谱纯，无水硫酸镁、氯化钠均为分析纯。PSA（乙二胺-N-丙基硅烷，粒度40～63 μm）粉购于CNW Technologies 公司；C18（40～60 目）、石墨化碳黑（GCB，120～400 目）、中性氧化铝粉（Al2O3，100～200 目）、碳纳米净化粉（NANO，纳米级）均购于北京振翔工贸有限公司；乙烯菌核利标准品有效成分含量大于99.5%，3,5-二氯苯胺标准品有效成分含量大于99.9%，均购自德国Dr.Ehrenstorfer 公司。

番茄、黄瓜、生菜、芹菜、柑橘和葡萄样品购自当地超市。

1.2 标准溶液的配制

准确称取适量乙烯菌核利及其代谢物3,5-二氯苯胺标准品，分别置于25 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容，分别配制成1.0 g/L 的标准储备液，-18℃冰箱中保存。使用前根据需要将标准储备液稀释成适当浓度的标准工作液，现配现用。

1.3 样品处理

1.3.1 提取

称取水果蔬菜类试样10 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入10 mL乙酸乙酯，涡旋1 min后，加入4.0 g无水硫酸镁、1.0 g氯化钠，迅速摇匀混合，置于水平振荡器中振荡15 min，以10000 r/min离心5 min，待净化。

1.3.2 净化

取上述1 mL上清液，将上清液置于1.5 mL高速离心管中，加入80 mg PSA和50 mg GCB粉，涡旋1 min，以12000 r/min离心5 min后，过0.22 µm滤膜于进样瓶中，注入气相色谱-质谱联用仪分析。

1.4 色谱与质谱条件

1.4.1 气相色谱（GC）条件

色谱柱：Agilent DB-5ms毛细管柱，30 m×0.25 mm（i.d.），0.25 μm；升温程序：初始温度70℃保持1.5 min，以10℃/min 速率升至160℃，再以20℃/min 升至280℃，保持5.0 min，总运行时间21.5 min；进样口温度：270℃；载气：氦气（99.999%以上），流速1.2 mL/min；进样量：1.0 μL；进样模式：脉冲无分流进样；溶剂延迟时间：5 min。

1.4.2 质谱（MS）条件

离子源：电子轰击源（EI）；离子源温度：230℃；电离能量：70 eV；传输线温度：280℃，扫描方式：选择离子监测（SIM），选择离子（*为定量离子，若有干扰，不同样品的定量离子可以从其他定性离子中选择）：212*/198/285（乙烯菌核利），161*/163/134（3,5-二氯苯胺）。

2 结果与讨论

2.1 吸附剂的选择优化

2.1.1 吸附剂的种类选择

QuEChERS 文献报道方法使用的吸附剂种类主要有PSA、C18 和GCB，为了考察吸附剂对乙烯菌核利和3,5-二氯苯胺吸附情况，本实验采用回收试验法筛选吸附剂的种类和用量。分别称取PSA、C18、GCB、Al2O3、NANO 粉于1.5 mL 高速离心管中，其中PSA、C18、GCB 吸附剂称取50 mg、80 mg、100 mg 三个水平，Al2O3、NANO 粉吸附剂称取20 mg、50 mg、100 mg 三个水平，每支离心管中分别加入0.1 mg/L 的乙烯菌核利和3,5-二氯苯胺混合标准溶液1.0 mL，涡旋1 min，静置10 min 后，以12000 r/min 离心10 min，取上清液过0.22 μm 滤膜于进样瓶中，GC/MS 上机分析。试验结果表明，纳米型吸附净化剂NANO 对3,5-二氯苯胺的吸附性较强，回收率损失较大，最高只有45.80%；中性氧化铝粉（Al2O3）对乙烯菌核利的回收率稍偏高，最高达135.31%，GCB 用量为80 mg 和100 mg 时对3,5-二氯苯胺的影响较大回收率只有46.23%和37.27%。PSA、C18 和50 mg 的GCB 对3,5-二氯苯胺和乙烯菌核利的吸附回收率都在85.45～122.28%之间，结果见图1。综合考虑GCB 对样品中极性和非极性的干扰物有极高的吸附能力，对去除植物中色素有十分显著的效果；PSA 对植物源样品基质中的有机酸、色素、糖类等都有较好的净化作用。因此，选择PSA、C18、GCB作为吸附净化剂进行吸附剂用量的方法研究。

图1 不同重量5 种吸附净化剂的回收率 Fig.1 Recoveries (%) of vinclozolin and its metabolite treated with five different sorbents at a series of weights

2.1.2 吸附剂的用量确定

蔬菜水果种类多，有的品种颜色较深，有的有挥发性成分，所以使用QuEChERS法进行提取和净化时还是要考虑两种或多种吸附净化剂组合使用，才可以较好的除去样品中的色素、脂肪酸等干扰仪器分析的物质。在2.1.1的试验结果基础上确定了80 mg PSA、50 mg GCB、50 mg C18的吸附剂种类并对这几种吸附剂进行组合Ⅰ（PSA 80 mg、GCB 50 mg），Ⅱ（PSA 80 mg、C18 50 mg），Ⅲ（GCB 50 mg、C18 50 mg），Ⅳ（PSA 80 mg、GCB 50 mg、C18 50 mg），进行加标回收实验。实验结果表明复配组合Ⅰ-Ⅳ都可以满足实验回收率的要求，四种复配净化剂的回收率都在94.57%～112.57%之间，结果见图2。并通过使用菜心提取液进行实际样品的净化，发现Ⅰ和Ⅳ吸附剂净化效果良好，净化后的提取液几乎无颜色。综合考虑净化效果、成本、便捷性，选择Ⅰ号80 mg PSA和50 mg GCB确定为最终实验的复配吸附净化剂的种类和用量。

图2 复配吸附净化剂的标准添加回收率 Fig.2 Average recoveries (%) of vinclozolin and its metabolite treated with four different sorbents

2.2 提取溶剂的筛选

原QuEChERS法使用的提取溶剂为乙腈，相对于多农残检测，乙腈是萃取范围较宽的溶剂。通过比较乙腈和乙酸乙酯的提取效果，结果表明乙酸乙酯和乙腈的提取效果都很好，乙烯菌核利的回收率分别为98.30%和94.07%，3,5-二氯苯胺的回收率分别为82.79%和94.07%。综合考虑，使用乙酸乙酯作为提取溶剂，简化了试验操作；如果用乙腈提取，上GC/MS仪器分析前还需用氮吹将转换溶剂，增加了实验步骤。因此，本方法使用乙酸乙酯作为水果蔬菜中乙烯菌核利和3,5-二氯苯胺残留的提取溶剂。

2.3 基质效应的消除

由于蔬菜、水果在前处理中会带入一些物质干扰仪器的分析，导致出现基质效应。用纯乙酸乙酯配制标准工作曲线进行添加回收实验进行定量时，发现乙烯菌核利和3,5-二氯苯胺残留测定值明显偏高，出现正的基质效应，用空白样品净化后基质配制标准工作曲线进行定量，回收率在正常范围之内。因此，为了消除基质效应的干扰，本方法使用样品空白净化后基体配制标准工作曲线进行定量。

2.4 优化后的QuEChERS 法确定

通过上述实验确定了QuEChERS方法中的提取溶剂，吸附净化剂的种类和用量，本部分通过实际空白样品的添加回收实验再次确定了优化后QuEChERS方法。优化后的QuEChERS法确定为：以乙酸乙酯做为提取溶剂，以80 mg PSA和50 mg GCB为吸附剂做混合型分散固相萃取。为了进一步验证前处理方法，称取了10.0 g的菜心样品，准确加入提取溶剂乙酸乙酯10 mL，加入萃取盐包（4.0 g无水硫酸镁和1.0 g氯化钠）；手动摇匀防止结块，水平振荡10～15 min，10000 r/min离心5 min，取上清液1.0 mL于装有Ⅰ净化剂的1.5 mL离心管中，涡旋2～5 min，12000 r/min高速离心，然后用0.22 µm有机滤膜过滤后装于1.5 mL进样瓶，上GC/MS分析。采用上述优化后的QuEChERS方法对菜心基质做提取净化的回收率实验，3,5-二氯苯胺的平均加标回收率为98.77%，乙烯菌核利平均加标回收率为106.26%。实验结果表明优化后的QuEChERS方法提取、净化效果优良，完全可以满足乙烯菌核利和3,5-二氯苯胺残留检测；GC/MS色谱图也表明该种前处理方法谱图杂峰少，基线噪声低，峰型好。

2.5 标准曲线及检出限

采用空白基质溶液配制乙烯菌核利和3,5-二氯苯胺杀菌剂混合标准工作液，配制成浓度分别为0.02、0.05、0.1、0.2、0.25 mg/L 的标准工作溶液，按1.4 中GC/MS 条件进样测定。以峰面积Y 为纵坐标，质量浓度X（mg/L）为横坐标，绘制标准工作曲线，得到其相关线性方程。结果表明，乙烯菌核利和3,5-二氯苯胺在0.02～0.25 mg/L 范围内线性关系良好，相关系数r2分别为0.997 和0.998，方法的检出限（LOD，S/N=3）乙烯菌核利在4.2～15.5 µg/kg 之间，3,5-二氯苯胺在6.3～17.6 µg/kg 之间。现以生菜空白基质配制的标准曲线线性方程和相关系数见表1，乙烯菌核利和3,5-二氯苯胺标准的总离子流图见图3a。

表1 乙烯菌核利及其代谢物的保留时间、质谱参数、线性方程和相关系数 Table 1 Retention times,GC/MS parameters,linear equations and r2 of vinclozolin and its metabolite

图3 乙烯菌核利及其代谢物标准（a，0.1 mg/kg）、番茄空白样品(b)和添加0.1 mg/kg 标准的番茄样品（c）总离子流图 Fig.3 Total ion chromatograms of vinclozolin and its metabolite standards (a,0.1 mg/kg),tomato blank (b) and tomato spiked with standards (c,0.1 mg/kg)

2.6 方法的回收率及精密度

按照1.3 提取和净化步骤，测定方法的回收率和精密度。选取黄瓜、生菜、芹菜、柑橘和葡萄空白样品中分别添加0.05、0.5、1.0 mg/kg（上机时根据线性方程范围进行适当的稀释）三个水平的标准，番茄添加水平为0.05、1.5、3.0 mg/kg，每个添加水平平行实验6 次，计算其平均回收率和相对标准偏差，结果见表2。结果表明，乙烯菌核利及其代谢物的平均回收率均处于81.67%～113.33%之间，相对标准偏差均小于9.47%。选取番茄空白样品和添加0.10 mg/kg 乙烯菌核利及其代谢物标准的番茄加标样品总离子流图见图3b，3c。

表2 几种蔬菜和水果中乙烯菌核利及其代谢物不同添加水平的实测值、回收率、相对标准偏差、最低检出限（n=6）Table 2 Measured values,average recoveries,RSDs and LOD of vinclozolin and 3,5-dichloroaniline standards spiked in different vegetables and fruits (n=6)

2.7 实际样品的测定

用改良后的QuEChERS 法检测了在广州市农贸市场上随机购买的菠菜、芥蓝、草莓等15 种蔬菜和水果样品，检测结果显示这15 种蔬菜和水果中乙烯菌核利和3,5-二氯苯胺均未检出。

3 结论

本文用改进的QuEChERS 方法结合GC/MS 法建立了果蔬中乙烯菌核利及其代谢物3,5-二氯苯胺残留量的测定方法。样品经乙酸乙酯提取，80 mg PSA 粉和50 mg GCB 粉吸附杂质净化后，用GC/MS 外标法定量。结果表明乙烯菌核利及其代谢物3,5-二氯苯胺在番茄、黄瓜、生菜、芹菜、柑橘和葡萄中添加水平为0.050～3.00 mg/kg 时，平均回收率范围均处于81.67%～113.33%之间，相对标准偏差（RSD）小于9.47%，检出限（LOD，生菜）分别为4.2 和6.3 µg/kg。本方法具有灵敏、快速、简便等特点，能满足新鲜蔬菜和水果中乙烯菌核利及其代谢物3,5-二氯苯胺的残留检测要求。