槲皮素对高脂饮食诱导肥胖小鼠结肠炎症的改善作用

曾钰鹏，卢晓丹，李国坤，董嘉华，陈骁熠，苏立杰

（广州医科大学公共卫生学院，广东广州 511436）

肥胖是体内脂肪积聚过多而导致体重增加的一种代谢紊乱状态[1]。肥胖会导致高血压、糖尿病、非酒精性脂肪肝、结肠癌等疾病，严重威胁人类健康[2]。肥胖和体内低程度的慢性炎症相关。高脂饮食诱发的肠道菌群紊乱使革兰氏阴性菌细胞壁裂解成分脂多糖（LPS）增加，而LPS 作为炎症触发因子与TLR4 受体结合激活NF-κB 信号通路，促进炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的合成和释放，从而导致相关组织产生炎症状态[3,4]。相关研究表明，高脂肪饮食可诱发结肠组织炎症[5-7]。结肠组织炎症会损害肠屏障功能和增加肠道通透性，增加的LPS 进入血液循环，引起体内低程度的慢性炎症，加剧肥胖以及产生胰岛素抵抗[8]。长期高脂饮食引起肠道炎症，增加肥胖和相关代谢性疾病的风险。因此，探索具有抗炎活性的天然产物以改善或治愈炎症已成为当前研究与开发的热点之一。

槲皮素（Quercetin）作为膳食中最常见的黄酮类化合物，广泛存在于蔬菜、水果和茶等食物中，具有抗氧化、抗炎、抗感染和抗肿瘤等多种生物活性作用[9,10]。高脂饮食中添加槲皮素可以改善肥胖，减少脂肪组织巨噬细胞浸润和炎症因子的表达，改善高脂引起的脂肪组织炎症[11,12]。槲皮素可调节由高脂饮食诱导的肥胖大鼠的肠道菌群，显著减低毛螺菌科菌等与肥胖相关菌科的丰度，增加Akkermansia等与缓解肥胖相关菌属的丰度，达到减肥效果[13]。

综上所述，高脂饮食所诱导的肠道菌群紊乱可能会导致肠道炎症，而槲皮素有调节肠道菌群和抑制炎症的作用。针对结肠炎症的抑制作用可能是治疗肥胖和肥胖相关代谢紊乱的一种潜在的治疗策略。本研究探索槲皮素对高脂饮食诱发肠道炎症的改善作用，并探讨其可能的作用机制，为深入研究开发以槲皮素为成分的功能食品提供理论依据。

1 材料方法

1.1 材料与试剂

槲皮素（98%），西安天丰生物科技股份有限公司；D12450B 低脂饲料（脂肪含量：10 kcal%）、D12451高脂饲料（脂肪含量：45 kcal%），广东省医学实验动物中心；TLR4 一抗、MyD88 一抗、NF-κB 一抗、IκBα一抗、p-IκBα一抗、TNF-α一抗、IL-6 一抗、IL-1β一抗，美国Affinity Biosciences 公司；无水乙醇、二甲苯、4%多聚甲醛，上海国药集团化学试剂有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）酶联免疫吸附测定试剂盒，苏州艾莱萨生物科技有限公司；Trizol、RNA逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR（Real-time PCR）试剂盒，日本Takara 公司。

1.2 仪器与设备

CFX96 型Real-time PCR 仪、PowerPac Basic 型电泳仪、T100 型梯度PCR 仪，美国Bio-Rad 公司；ODYSSEY 型化学发光仪，美国LI-COR 公司；JJ-12J脱水机、JB-P5 型包埋机、JB-L5 冻台，武汉俊杰电子有限公司；RM2016 型病理切片机，上海莱卡仪器有限公司；GFL-230 型烤箱，天津市莱波瑞仪器设备有限公司；TSY-B 脱色摇床、MX-F 涡旋混合器、D1008E掌上离心机，Servicebio 公司；XSP-C204 显微镜，CIC公司。

1.3 方法

1.3.1 实验动物及饲养条件

SPF 级健康C57BL/6 雄性小鼠30 只，体重22～25 g，合格证号：NO.44007200049595，许可证号：SCXK(粤)2013-0002，购于广东省医学实验动物中心，饲养于广州医科大学实验动物中心SPF级屏障环境实验室，室温22±2℃，相对湿度50%～70%，清洁安静，12 h、12 h 明暗周期的照明条件。小鼠饲养期间自由摄食、饮水。小鼠经一周的适应性饲养及分组（具体分组见表1）后，开始正式试验。试验持续20 周，期间每日下午以灌胃方式给予槲皮素或生理盐水，每日称量饲料记录小鼠摄食情况，每周称量小鼠体重记录小鼠体重变化。小鼠饲养20 周后，禁食（不禁水）8 h。禁食结束后，给小鼠注射麻醉剂（10%的水合氯醛），剂量为0.1 mL/只。小鼠经摘眼球取血后，脱颈椎处死小鼠，用剪刀打开其腹腔，取出小鼠的结肠、结肠内容物。剪取部分结肠组织放入装有4%多聚甲醛固定液的离心管中，常温放置，用于后续的苏木精-伊红染色及观察；其余组织分别放入编号记号的2 mL 冻存管中，用液氮速冻后保存于-80℃的超低温冰箱。本试验经过广州医科大学实验动物福利伦理委员会审批。

表1 实验动物分组 Table 1 Animal grouping

1.3.2 苏木精-伊红染色

切取适量结肠组织放入4%多聚甲醛固定液中，固定24～48 h。取出固定后组织，流水冲洗2～10 h。用低浓度酒精到高浓度酒精依次进行脱水。二甲苯浸泡15 min，浸泡两次。用软蜡 (熔点为52～56℃)浸泡15 min，浸泡两次。将浸好蜡的组织块放入包埋框中用硬蜡包埋，修块备用。将石蜡块用切片机切成5～8 µm 厚的切片，用干净的涂多聚赖氨酸的载玻片贴片。将铺好的切片在40℃下烘干。依次将切片进行脱蜡与复水。从蒸馏水中取出后，放入苏木精溶液中染色10～30 min；将切片放入1%的盐酸酒精数秒至切片变红即可，流水冲洗使切片返蓝；再次脱水处理；用0.5%伊红乙醇溶液染色2～5 min；切片脱水透明。将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片，做好标记便于后面观察。

1.3.3 Real-time PCR

用Trizol 试剂提取所需总RNA，测取每份样品RNA 浓度，并稀释到250 mg/L，定总RNA 浓度为500 ng，分别取每份稀释后样品2 μL，配上额定的水和逆转录试剂后进行RNA 逆转录。逆转录后检测DNA 浓度，确定合格后再向八连管中加入1 μL cDNA 及混合物，加盖混匀。PCR 反应体系10 μL，反应条件95℃30 s 预变性；95℃ 5 s，60℃ 30 s 扩增，39 个循环；65℃ 5 s，95℃ 0.05 s 熔解。采用2-ΔΔCt法表示各组mRNA 表达量。PCR 引物序列见表2。

表2 引物信息表 Table 2 Primer sequence

1.3.4 蛋白免疫印迹（Western blotting）

从-80℃冰箱中取出适量结肠组织，研磨离心并吸取上清液，按BCA 试剂盒说明书检测蛋白浓度，计算并按比例将5×蛋白上样缓冲液、超纯水和样品加入无菌离心管中，4℃离心混匀后，95℃金属浴煮混合液体10 min，再次短暂离心，混匀后均等分成3 份，1 份放-20℃冰箱备用，余下放-80℃冰箱保存。配浓缩胶和的分离胶，所有样品浓度均为5 g/L，每个胶孔加入样品10 μL 并进行凝胶电泳，剪PVDF 膜，切胶后，膜与胶条贴好夹紧后放入转膜槽中进行恒流转膜（300 mA，100 min），5%脱脂牛奶封闭2 h，一抗4℃孵育16 h 过夜，次日进行37℃，1 h 的二抗孵育，洗膜3 次，发光并采图保存。使用Image J 测定目的条带与内参β-actin 灰度值比值表示所测蛋白的表达水平。

1.3.5 数据统计与分析

试验数据采用GraphPad Prism 7.0 软件进行统计分析，多组数据的组间比较采用非配对双尾t 检验（Unpaired two-tailed t test），试验结果以平均值±标准差（Mean±SD）表示。

2 结果与分析

2.1 槲皮素干预对各组小鼠体重的影响

各组小鼠的体重增加量如图1所示。饲养20周后，HF 组小鼠的体重增加量为14.05 g，显著高于LF 组小鼠的体重增加量（p<0.05）；而HF+Q 组小鼠的体重增加量为7.83 g，显著低于HF组的体重增加量（p<0.05）。因此，槲皮素干预能有效降低肥胖小鼠的体重增长。相关研究的结果也表明槲皮素具有降低高脂饮食诱导的体重增加的作用[11-12]，与本研究的结果相一致。

图1 槲皮素对小鼠体重增加的影响 Fig.1 Effect of quercetin on weight gain in obese mice

2.2 槲皮素干预对各组小鼠结肠组织病理情况的影响

图2 所示，在LF 组中，结肠绒毛排列整齐有序，隐窝结构、结肠黏膜结构较为完整。在HF 组中，结肠绒毛出现不规则排列，隐窝结构有较为明显的损伤，杯状细胞数量著减少，有较为明显的炎性浸润现象。在HF+Q 组中，肠绒毛和隐窝结构排列较为有序，没有出现明显的炎性浸润。因此，在高脂饮食引发的肥胖小鼠结肠组织炎症现象中，槲皮素干预能修复肥胖小鼠的结肠形态学上的损伤。有研究报道在高脂日粮喂食引发的肥胖大鼠结肠组织炎症现象中，通过低聚木糖的灌胃能明显改善大鼠结肠形态学上的损伤[14]。

图2 槲皮素对结肠组织病理情况的影响（×200）Fig.2 Effect of quercetin on pathological condition of colon in obese mice (×200)

2.3 槲皮素干预对各组小鼠肠内容物中脂多糖含量的影响

炎症作为肥胖和相关代谢性疾病的一个关键因素已被广泛认可。触发炎症产生的主要来源是肠道中的革兰氏阴性菌的菌壁成分-脂多糖（LPS）[15]。高脂肪饮食诱发的肥胖和肠道炎症以及血浆LPS浓度增加密切相关[16]。如图3 所示，HF 组小鼠肠内容物中LPS含量为7.01 ng/mL，相比于LF 组（4.18 ng/mL）显著升高（p<0.05），而HF+Q 组小鼠肠道内容物中的LPS含量为5.04 ng/mL，相比于HF 组降低约28.10%的含量（p<0.05）。有研究报道槲皮素可以通过调节肠道菌群和增强肠屏障功能，从而减少血液中的LPS 浓度来干预高脂饮食诱导肥胖小鼠非酒精性脂肪肝[17]。本研究结果提示槲皮素可能通过纠正高脂膳食诱导的肠道菌群紊乱，减少LPS 产生，降低肠道炎症反应的触发作用。

图3 槲皮素对小鼠肠内容物中LPS 含量的影响 Fig.3 Effect of quercetin on LPS content in obese mice

2.4 槲皮素干预对各组小鼠结肠组织相关炎症因子表达的影响

图4 槲皮素对小鼠结肠组织中相关炎症因子mRNA 表达影响 Fig.4 Effect of quercetin on relative mRNA expression of inflammatory cytokines in colon tissues

LPS 水平的增加与局部组织中的低程度慢性炎症相关[18]，因此检测了结肠组织中炎性因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）的表达情况。Real-time PCR 结果如图4 所示，HF 组小鼠TNF-αmRNA 表达水平相对于LF组上升约3.06 倍（p<0.05），IL-1βmRNA 表达水平约升高3.16 倍（p<0.05），IL-6mRNA 表达水平约升高2.55 倍（p<0.05）。

而槲皮素干预可以显著降低TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA 表达水平（p<0.05），相对于HF 组，槲皮素干预分别抑制TNF-α（55.37%）、IL-1β（35.12%）和IL-6（52.55%）的mRNA 表达。Western Blot 结果如图5 所示，HF 组小鼠TNF-α、IL-1β和IL-6 的蛋白水平明显高于LF 组（p<0.05），分别增加约TNF-α（2.10倍）、IL-1β（2.20 倍）和IL-6（1.61 倍）的蛋白表达。而与HF 组相比，HF+Q 组小鼠TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表达水平显著下降（p<0.05），分别抑制TNF-α（39.04%）、IL-1β（17.73%）和IL-6（25.47%）的蛋白表达。

图5 槲皮素对小鼠结肠组织中相关炎症因子蛋白表达影响 Fig.5 Effect of quercetin on relative protein expression of inflammatory cytokines in colon tissues

TNF-α主要是由巨噬细胞产生的促炎性细胞因子，其在结肠炎模型中的表达会升高，与炎症程度呈正相关[19]。本研究中，TNF-α的表达水平在HF 组中升高，而槲皮素干预可以显著降低TNF-α的表达水平。槲皮素干预也可以显著降低结肠组织中IL-1β和IL-6 的表达水平。与槲皮素类似，同属于黄酮类化合物的芹菜素也可以降低IL-1β和IL-6 在结肠中的表达水平以及嗜酸性粒细胞浸润，从而抑制肥胖小鼠的结肠炎症[20]。有研究报道辣木油显著降低结肠中炎性因子IL-1β和IL-6 的表达，对LPS 诱导小鼠肠道炎症有改善作用[21]。本研究结果提示，槲皮素对高脂饮食诱导结肠炎症的改善作用可能与降低炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6 的表达相关。

2.5 槲皮素干预对各组小鼠结肠组织TLR4/NF-κB 信号通路的影响

TLR4/NF-κB 信号通路在结肠炎症的发生中发挥重要作用[22]。LPS 可通过TLR4 受体和衔接蛋白MyD88，激活NF-κB 信号通路，促进炎性因子的转录[23]。而IκBα蛋白在受到外来刺激后，可与NF-κB 解离后降解，使NF-κB 活化，最终引起一系列的炎症反应[24]。因此检测了TLR4 和其适配器蛋白MyD88 以及下游信号分子（NFκB，IκBα和p-IκBα）的蛋白表达。结果如图6 所示，HF 组小鼠结肠组织的TLR4、MyD88、NF-κB 和p-IκBα的表达水平显著高于LF 组（p<0.05），分别增加TLR4（1.80 倍）、MyD88（2.24倍）、NF-κB（3.02 倍）和p-IκBα（2.21 倍）的蛋白表达，HF 组IκBα的蛋白表达水平相对LF 组约下降37.67%。而HF+Q 组TLR4、MyD88、NF-κB 和p-IκBα的表达水平相比于HF 组有显著下降，分别抑制TLR4（27.06%）、MyD88（44.51%）、NF-κB（44.10%）和p-IκBα（31.38%）的蛋白表达。HF+Q 组IκBα的表达水平相比于HF 组显著升高，增加约1.21 倍的蛋白表达，提示槲皮素可以抑制IκBα降解，从而抑制NF-κB的活化。这些结果说明高脂饮食诱导的肥胖小鼠结肠中的TLR4/NF-κB 炎性信号通路被激活，而槲皮素干预对该信号通路的激活有抑制作用。有研究报道槲皮素在Caco-2细胞中可以调节TLR4/NF-κB信号通路影响IL-6、IL-1β和TNF-α等炎性因子的产生[25]。赤小豆可能通过抑制NF-κB 信号通路的激活，降低相关炎性因子表达水平，从而抑制高脂饮食诱导肥胖小鼠的结肠组织炎症[26]。本研究结果提示在高脂饮食诱导的结肠炎症中，槲皮素干预可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的激活来降低相关炎性因子的表达。

图6 槲皮素对小鼠结肠组织中TLR4/NF-κB 信号通路的影响 Fig.6 Effect of quercetin on the TLR4/NF-κB signaling pathway in colon tissues

3 结论

研究发现，槲皮素可通过减少肠内容物中LPS 含量，限制TLR4 与其结合，抑制TLR4 通路信号转导，下调下游信号分子表达，最终减少促炎因子，缓解高脂饮食诱导的结肠炎症损伤。本研究为槲皮素用于预防和治疗肠道炎症和肥胖提供新的思路。