桦褐孔菌总三萜类化合物对小鼠肝损伤的保护作用

鞠春梅，杜延佳，梁新合，吴孟雅，张辉*，李艳杰*

（1.长春中医药大学药学院，吉林长春 130117）（2.东北亚生物科技有限公司，吉林长春 130000）（3.长春中医药大学人参科学研究院，吉林长春 130117）

肝脏作为人体最大的器官，主要负责清除许多毒物、化学物质和药物。药物性肝损伤是指由各种处方药或非处方药诱发的肝损伤，其中包括小分子化学药物、生物制剂、中药、天然药物、保健品和膳食补充剂等[1]。其中对乙酰氨基酚（APAP）是一种传统的非甾体解热镇痛药物，APAP 作为日常中常见的药物，作用相对安全，并且在治疗剂量范围内几乎没有副作用，广泛用于治疗各种疼痛。然而在过去的几年中，临床数据监测表明，过量服用APAP 可出现肝毒性、肾毒性和急性肝衰竭[2]，高剂量的APAP 在细胞色素P450 酶系统（即cyp2e1 和cyp3a4 同工酶）的氧化作用下生成N-乙酰-P-苯丙醌亚胺（NAPQI），NAPQI是一种高毒性代谢产物，可以通过大量结合谷胱甘肽，并耗尽谷胱甘肽后，与肝细胞内蛋白质结合，形成蛋白质结合物，引起细胞内氧化应激，线粒体损伤、DNA损伤，最终导致肝坏死[3-5]。

桦褐孔菌被认定是一种无毒害作用的可食用真菌，在我国的黑龙江、吉林两省资源较丰富，其作为食用真菌药物的应用在俄罗斯已经通过相关部门的官方批准，并获得了美国FDA 的认证[6]。桦褐孔菌具有抗炎症、抗肿瘤、抗真菌、抗病毒、提高机体免疫力、保肝和抗氧化等活性[7]。因具有多种生物活性，被认为是一种珍贵的、具有极好疗效的药物，也是具有发展前途和开发价值的经济适用性药食同源植物。桦褐孔菌中主要含有多糖、三萜、多酚等成分。大量研究显示，三萜类具有抗氧化、抗癌、抗病毒，抗炎和防止糖尿病[8]等功能。王文娟等[9]研究发现桦褐孔菌提取物能改变肿瘤细胞增殖周期使其滞留于G2 期从而显著抑制肝癌细胞HepG2 的增值，对肝癌细胞有抑制作用，说明桦褐孔菌对肝细胞有一定的保护作用。但桦褐孔菌中三萜类是否能够通过抗氧化应激对APAP 引起的肝损伤有保护效果未见报道。本文以桦褐孔菌子实体为原料，经过回流提取、硅胶柱分离纯化得到桦褐孔菌总三萜（Triterpenoids ofInonotus obliquus，TIO），通过APAP 急性肝损伤模型实验，探究TIO 的保肝作用，为桦褐孔菌三萜类化合物的进一步研究提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

供试品TIO 由羊毛甾醇（20.00%）、桦褐孔菌醇（20.63%）、麦角甾醇（24.19%）、白桦脂醇（6.45%）、3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛（20.76%）组成，由实验室制备；SPF 级ICR 雄性小鼠，体重22～25 g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，合格证号：SCX（吉）2016-0004。

1.2 主要试剂

对乙酰氨基酚（APAP），购于美国Sigma 公司；水飞蓟素，购自于上海瀚鸿科技股份有限公司；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性、还原型谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）测试盒，苏木素-伊红染色液（HE），Hoechst 33258 染色试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；生理盐水购自长春豪邦药业公司。

1.3 主要仪器

BP211D 型十万分之一电子天平，北京赛多利斯天平有限公司；Elx800 型酶标仪，美国Bio-Rad 公司；5430R 冷冻离心机，美国LUNAR 公司；YZ-875 超净工作台，苏州净化设备厂；KQ5200 型超声波清洗器，昆山市超声仪器公司；FSH-2A 可调高速匀浆机，常州金坛良友仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 桦褐孔菌总三萜（TIO）制备

取桦褐孔菌干燥子实体粗粉适量，经二氯甲烷水浴回流提取、除杂、减压回收溶剂，浓缩，挥干溶剂得到干膏。干法上样，采用硅胶柱色谱分离，以石油醚:乙酸乙酯=8:2 等度洗脱，点板合瓶分成Fr1-Fr7 组分，组分Fr2 采用石油醚:乙酸乙酯=9:1～8:2 梯度洗脱，点板合瓶，合并出5 个组分为Fr 2-1～Fr 2-5，同时纯化得到3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛、桦褐孔菌醇和白 桦脂醇。对Fr5 组分采用中压柱色谱分离，以石油醚:乙酸乙酯=6:4等度洗脱，得到5个组分为Fr 5-1～Fr 5-5，同时纯化得到羊毛甾醇；对组分Fr 5-3 正相硅胶柱色谱层析，以石油醚:乙酸乙酯=8:2～6:4 梯度洗脱，得到3个组分，同时纯化得到麦角甾醇。将五个成分按一定配比成TIO，用0.5%羧甲基纤维素钠混悬至规定浓度，待小鼠灌胃使用。

1.4.2 动物分组及处理

将小鼠随机分成6 组，每组8 只。表1 为动物实验设计，空白组与模型组小鼠分别给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液，水飞蓟素组与TIO 干预组小鼠分别按照剂量50 mg/kg、15 mg/kg、30 mg/kg 和60 mg/kg 连续7 d 灌胃给药，末次给药后，空白组小鼠注射0.9%的生理盐水，除空白组小鼠外均一次性腹腔注射300 mg/kg APAP 制造肝损伤模型。24 h 后小鼠眼球取血，血液室温凝结1 h 后，4000 r/min 离心15 min，留取上清供血清指标检测。切取一部分肝脏组织溶于0.9%氯化钠中制成肝匀浆用于氧化应激水平检测，另取相同部位的肝组织固定在4%多聚甲醛中，用于肝组织切片观察病理变化，其余部分立即冻存在-80℃冰箱。

表1 动物实验设计 Table 1 Animal experiment design

1.4.3 免疫器官指数检测

取小鼠肝脏和脾脏称重记录，计算脏器指数。肝脏（脾脏）指数=肝脏（脾脏）质量/体质量。

1.4.4 血清指标检测

小鼠进行眼球取血，静置离心后留取上清液，按照试剂盒的操作说明测定检测ALT、AST 酶活力。

1.4.5 氧化应激指标检测

取-80℃冻存的小鼠肝组织，置于冰上解冻后，加入生理盐水，制备匀浆，留取上清液，按照SOD、GSH和MDA 试剂盒的操作说明书测定相关指标。

1.4.6 HE 染色检测肝组织病变

将肝组织浸入4%多聚甲醛溶液，24 h 后修整，石蜡包埋，切成5 μm 切片，脱蜡至水，按HE 染色步骤进行染色，光学显微镜观察肝组织病理变化。

1.4.7 Hoechst 33258 染色检测肝细胞凋亡

从每组中随机选择三个肝组织，切成5 μm 切片，按Hoechst 33258 染色步骤进行染色。静置3～5 min 后用PBS 洗涤三次。用荧光淬灭封片液封片，避光烘干后于荧光显微镜下观察细胞核凋亡情况。

1.4.8 统计学处理

采用单因素方差分析（ANOVA）对数据进行分析，使用Graphpadprism 5.0 创建结果数据图表。p<0.01 或p<0.05，具有显著性，被认为具有统计意义。

2 结果与讨论

2.1 对小鼠体重和器官指数的影响

动物脏器重量、脏器指数作为动物实验中常用的重要基础数据，一定程度上可以反映药物对脏器的影响或损伤程度[10]。如表2 所示，各组小鼠的初始体重差异不明显。给药一周后，模型组小鼠的肝脏指数为72.37、脾脏指数6.56，与空白组肝指数62.52、脾脏指数4.80 相比有明显差异（p<0.05），说明APAP 能够使小鼠发生肝、脾肿胀现象。与模型组相比，加入TIO干预与水飞蓟素治疗后可以降低小鼠肝脏和脾脏指数。表明不同质量浓度TIO 对小鼠APAP 急性肝损伤均具有一定疗效。因此选择15、30、60 mg/kg 作为TIO低、中、高剂量进行干预治疗。

表2 桦褐孔菌三萜对小鼠体重与器官指数的影响 Table 2 Effects of TIO on body weights and organ indices in mice (,n=8)

表2 桦褐孔菌三萜对小鼠体重与器官指数的影响 Table 2 Effects of TIO on body weights and organ indices in mice (,n=8)

注：“*”表示与模型组相比较有显著差异（p<0.05）。

2.2 TIO 对小鼠血清生化指标的影响及氧化应激指标的影响

血清中ALT、AST 属于药物性肝损伤的生物标志物[11,12]，AST 和ALT 是检测肝功能最重要、最敏感的指标，其活性的高低直接反映了肝脏受损的程度[13]。正常状态下ALT 和AST 存在于肝细胞浆中，当过量服用APAP 后，当体内的毒性产物不能及时排除体外，与肝组织内的蛋白质结合，引起肝细胞受损，AST 和ALT 会从肝脏渗漏到细胞外间隙血液中，从而导致二者血清浓度急剧升高。表3 所示，空白组小鼠血清ALT和AST 分别是5.66 U/L、7.62 U/L，而模型组小鼠血清中的含量显著上升到13.54 U/L、16.39 U/L，说明小鼠APAP 型肝损伤造模成功。水飞蓟素组和TIO 干预组小鼠血清ALT 和AST 活性与模型组相比均降低，且TIO高剂量组效果最好，显著降低血清中ALT 和AST 活力至8.38 U/L 和11.13 U/L，最高降低了47.56%，说明TIO 能够减轻或阻断由过氧化引起的肝细胞膜损伤导致的肝细胞坏死，从而达到降低ALT 和AST 效果。

表3 血清生化指标结果 Table 3 Serum biochemical index results

氧化应激也是药物引起肝毒性的最常见原因[14,15]。在APAP 过量时，大量的NAPQI 产生会耗尽肝脏中主要产生的GSH[16]，当GSH 消耗殆尽时肝脏失去清除自由基作用，肝脏新陈代谢受到影响。所以GSH 的含量直接反映了自由基损耗细胞的程度[17]。MDA 是一种膜脂过氧化物的产物[18,19]，通过测定MDA 的含量可以了解膜脂过氧化程度，可以间接测定膜系统受损程度。SOD 是保护活性氧反应的重要的酶，可以反映机体过氧化损伤程度[20]。通过测定小鼠肝组织中SOD、GSH和MDA 的活性，进而初步确定药物是否具有肝保护作用。表4 可见，模型组小鼠肝脏SOD 活性为510.62 U/(mg pro)、GSH 活性为93.90 U/(mg pro)；TIO 干预组相比于模型组，SOD、GSH 活性均显著升高，且TIO高剂量组SOD 活性效果最好，其活性升高为628.39 U/(mg pro)，最高升高了49.34%。与模型组相比，TIO干预组与水飞蓟素组MDA 含量均显著降低，且TIO中剂量干预组效果最好，减少至20.71 pmol/(mg pro)，最高降低了72.23%。说明TIO 能够通过增强SOD 及GSH 的活性，减少细胞膜脂质过氧化产物MDA 的含量，促使肝细胞的抗氧化能力增强，从而抵御脂质过氧化，降低肝细胞受损程度，达到保肝护肝的目的。

表4 氧化应激指标结果 Table 4 Oxidative stress index results

2.3 TIO 对小鼠对小鼠肝组织病理学和肝细胞凋亡的影响

肝组织的病理学检查同样是肝损伤诊断的有效手段，对于肝损伤有鉴别诊断及早期准确的评估肝损伤至关重要。APAP 是目前应用最广泛的解热镇痛药物，长期或过量服用会引起严重的肝损伤，主要表现为肝坏死，以肝脏小叶中央型坏死最为常见[21,22]，将六组肝脏组织切片进行HE 染色。结果如图1 所示，正常小鼠肝脏可见清晰的肝小叶结构，肝细胞排列整齐致密，细胞索呈放射状排列在中央静脉周围；模型组肝组织结构破坏，肝小叶结构不清晰，肝细胞水肿明显，部分肝细胞有明显的点状和灶状坏死，紊乱等典型病理特征。进一步证实了APAP 诱导的急性肝损伤模型建立成功。相比于模型组，经不同浓度TIO 干预及水飞蓟素保护后，肝细胞状态有所恢复，肝脏结构较清楚，少量细胞点状坏死，肝细胞水肿明显减轻。TIO 高剂量组与水飞蓟素组比较，无明显差异，说明TIO 能显著改善小鼠肝细胞变性和坏死，其治疗效果较好。

图1 TIO 对APAP 致急性肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响（×100）Fig.1 Effect of TIO on the pathological changes of liver tissue in mice with acute liver injury induced by APAP (×100)

同时为了确定TIO 是否能缓解APAP 诱导的肝细胞凋亡，我们采用Hoechst 33258 染色观察肝细胞凋亡的程度。如图2 所示，空白组小鼠的肝细胞核形态完整，整齐排列，轮廓清晰，染色质均匀并轻微染色。然而，模型组中可以清楚的观察到大面积，高密度的蓝色凋亡肝细胞且分布不均，细胞核缩小，呈不规则状，且有较强荧光团出现。与模型组相比，用TIO 不同浓度连续干预7 d 处理后，细胞凋亡数量明显减少，荧光团明显减弱，且随TIO 浓度增加，肝细胞凋亡情况明显改善。TIO 高剂量组与水飞蓟素组比较，无明显差异，说明TIO 能明显抑制APAP 引起的肝细胞损伤凋亡。

图2 TIO 对APAP 致急性肝损伤小鼠肝组织凋亡的影响（×400）Fig.2 Effect of TIO on liver tissue apoptosis in mice with acute liver injury induced by APAP (×400)

3 结论

综上所述，TIO 可以明显减轻APAP 引起的急性肝损伤，对肝脏及其功能有一定的保护作用，在给予不同剂量TIO 干预后，血清生化指标ALT 和AST 均显著性降低；同时TIO 高剂量干预组升高小鼠肝组织中的氧化应激指标SOD 和GSH 含量，降低MDA 含量；TIO 干预后肝组织细胞坏死和紊乱现象明显改善，肝细胞凋亡数量明显减少。其机制可能通过减轻氧化应激和抑制凋亡有关。因此对桦褐孔菌总三萜作为一种具有潜力的护肝功能食品原料的研究有重要意义。