杨树菇凝集素诱导C57BL/6小鼠肝损伤和活化CD8+T细胞

李岳亮，陈丽琼，文钰棣，黄壮霖，曾淑娴，梁一

（广东医科大学医学技术学院检验医学研究所，广东省医学分子诊断重点实验室，广东东莞 523808）

食用型蘑菇具有美味、营养和药用价值高等特点，它富含各种酶和生物活性物质，包括多糖、多萜、酚类、活性多肽/蛋白等，其具有抗肿瘤、降血压、抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫调节等作用，因此，在中国、美国、荷兰、波兰等国家倍受欢迎[1]。

蘑菇的毒性研究主要集中在毒蘑菇中的毒伞肽、毒蝇蕈醇、鹅膏蕈氨酸等活性作用[2,3]，食用蘑菇的毒性报道较少。例如欧洲、北美食用已久的黄口菇，近期被报道过量食用会造成横纹肌溶解，并伴随血浆肌酸激酶和肝脏转氨酶的异常升高[4]。在亚洲被称为“天使之翼”的贝形圆孢侧耳在日本因其脱髓鞘活性引发的脑病致死17人[5]。还有一些食用蘑菇例如双孢蘑菇、鸡油菌、平菇等，或可诱导突变、溶肌、脏器出血、肝脏炎症等作用[6]。食用蘑菇中被鉴定到的毒性成分包括林地蘑菇、鸡油菌中有微量的毒伞肽[6]，亚稀褶黑菇含有cycloprop-2-ene carboxylic acid，棕灰口蘑含有saponaceolide B 和M，平菇中含有造成高钾血症、心动过缓的磷脂酶蛋白和抑制蛋白合成的奥来毒素[7]，双孢蘑菇中的Agaritin 可诱导突变，贝形圆孢侧耳含有一种二甲亚胺氨基酸，金针菇中含有心脏毒性的flammutoxin 蛋白等。毒性成分的鉴定难度也是食用菌毒性有所争议的重要原因之一。

杨树菇（Agrocybe aegerita）是一种常用的食用蘑菇，之前研究发现，杨树菇水提物组分在小鼠试验中表现出致死作用，半致死剂量（LD50）为8.77 g/kg，在BALB/c 小鼠模型中，水提物组分灌胃有显著的肝脏毒性[8]。进一步研究发现，水提物中蛋白组分主要是凝集素AAL（Agrocybe aegeritalectin），它是由含有碳水化合物特异性识别区域的158 个氨基酸组成的分子量为18 ku 的半乳糖凝集素，具有抗肿瘤凋亡活性[9]。AAL 可诱导HeLa 细胞[10]和肝癌细胞[11]凋亡，对消化酶的作用耐受，口服或尾静脉注射具有显著的肝脏毒性[8]。AAL 的肝脏毒性损伤机制不明，因此，本文将研究AAL 在C57BL/6 小鼠模型中的作用，为食用蘑菇毒性研究和安全饮食提供数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

C57BL/6 小鼠，雌性，SPF 级，6～8 周龄，购于南方医科大学，动物合格证书由广东省实验动物研究所出具。

小鼠谷丙转氨酶（ALT）试剂盒，小鼠谷草转氨酶（AST）试剂盒，南京建成生物工程研究所；Trizol，Invitrogen；逆转录试剂盒（RR047A），Takara；SYBR（RR820A），Takara；Anti-mouse CD3e FITC，eBioscience；Anti-mouse NK1.1 APC，eBioscience；Anti-mouse F4/80-APC-eFluor，eBioscience ；Anti-mouse CD4-APC-eFluor，eBioscience；Anti-mouse CD8a PerCP Cyanine5.5，eBioscience；GAPDH，F：5′-G CAGTGGCAAAGTGGAGATT-3′，R：5′-CGCTCCTG GAAGATGGTGAT-3′；IL-10，F：5′-ACAACATACTG CTAACCGACTC-3′，R：5′-CTGGATCATTTCCGATA AGG-3′；IL-33，F：5′-GATGGGAAGAAGCTGATGGT G-3′，R：5′-TTGTGAAGGACGAAGAAGGC-3′；IL-27，F：5′-CTGTTGCTGCTACCCTTGCT-3′，R：5′-GGAA ACATTGGGAAGATGGTAT-3′；IFN-γ，F：5′-AGCAA CAACATAAGCGTCAT-3′，R：5′-CCTCAAACTTGGC AATACTC-3′；TNF-α，F：5′-CTACTGAACTTCGGGG TGAT-3′，R：5′-CAGGCTTGTCACTCGAATT-3′。

1.2 实验方法

1.2.1 杨树菇凝集素的制备

杨树菇子实体购买自福建省三明食用菌研究所，将之研磨成干粉后，通过浸泡、过滤和离心方式收集滤液。在滤液中加入硫酸铵至饱和度为40%，搅拌20 min 后离心弃沉淀收集上清。在上清中加入硫酸铵至80%饱和度，沉淀60 min 后离心收集沉淀。用磷酸盐缓冲溶液（PBS）重悬沉淀并将之透析除盐得到杨树菇总蛋白。将杨树菇总蛋白用0.45 μm 的滤膜进行抽滤。安装lactose 亲和层析柱，用PBS 平衡柱子30 min，调节机器的流速为1 mL/min。将杨树菇总蛋白溶液（置于冰上）上样到亲和层析柱。然后用PBS 溶液冲洗杂蛋白，直到280 nm 吸收线处于水平。用200 mMα-lactose PBS 缓冲液洗脱并收集目的蛋白AAL，并在PBS 缓冲液中充分透析，真空干燥后于-20℃保存。

1.2.2 AAL 诱导C57BL/6 小鼠肝脏损伤

将AAL 溶解在无菌PBS 中，配制成2.5 mg/mL的AAL 溶液。根据不同处理时间0 h、6 h 和9 h 把小鼠分为三组，每个处理组的小鼠数量n=7。0 h 组注射无菌PBS 溶液，6 h 组和9 h 组按照2.5 mg/kg 的剂量将AAL 尾静脉注射到C57BL/6 小鼠体内处理6 h 和9 h。三个时间点进行眼球采血，同时处死小鼠。血清用于检测转氨酶ALT 和AST 的活性，取小鼠部分肝脏组织做石蜡组织切片，部分肝脏组织用于提取肝脏总RNA 和单个核细胞分离、染色。

1.2.3 小鼠血清ALT 和AST 的检测

使用南京建成生物工程研究所的ALT 和AST 试剂盒，按照试剂盒说明书分别测定小鼠血清中的ALT和AST 两项指标。

1.2.4 小鼠肝脏组织石蜡切片与苏木精-伊红染色法（HE 染色）

小鼠眼球取血处死后，取肝脏组织，剪下一块组织（1.5 cm×1 cm×0.5 cm）置于包埋盒中，通过脱水、浸蜡、包埋、冰冻等操作后，用组织切片机将肝脏组织切成3 μm 厚的薄片。制作好的组织切片用HE 染色后，进行脱水、透明、封片等操作，以便在镜下观察。

1.2.5 Real-time PCR 测定小鼠肝脏组织细胞因子表达

用Trizol 法提取肝组织中的RNA，按照Takara的逆转录试剂盒说明书将肝脏组织中的RNA 逆转录为cDNA。按照Takara 的SYBR（RR820A）试剂说明书，用荧光定量PCR 仪检测并分析GAPDH、IL-10、IL-33、IL-27、IFN-γ和TNF-α的mRNA 表达水平。

1.2.6 小鼠肝脏单个核细胞表面抗原染色

小鼠眼球取血处死后，取肝脏组织。用生理盐水灌注清洗肝脏组织，并通过切块、研磨、胰酶消化和过滤将提取肝脏细胞。将提取的细胞用RPMI1640 培养基重悬并800×g 离心5 min。重复上述步骤一次后弃上清，用15 mL 33% Percoll 分离液将离心后的细胞沉淀重悬。室温条件下，800×g 离心30 min，弃上清。往细胞沉淀中加入1 mL RBC lysing buffer 破碎红细胞，3 min 后加入9 mL RPMI1640 培养基终止反应。800×g 离心5 min 后用RPMI1640 培养基重悬，重复上述步骤一次后获得单个核细胞。

设置空白对照管和单标抗体管。在100 μL 重悬细胞液中加入 Anti-mouse-NK1.1-APC、Anti-mouse-CD3e-FITC、Anti-mouse-NK1.1-APC、Anti-mouse-CD69-PE，Anti-mouse-F4/80-APC-eFluor、Anti-mouseCD4-APC-eFluor、Anti-mouse-CD8a-PerCP Cyanine5.5，4℃避光孵育30 min。加入3 mL PBS，1500 r/min 离心5 min 弃上清收集细胞，重复上述步骤一次，最后加入200 μL 2%多聚甲醛，避光4℃保存，24 h 内上机分析。

1.3 统计学方法

用SPSS 统计软件分析数据。小鼠血清ALT、AST检测结果，RT-PCR结果和流式细胞术结果均用（）表示，p值小于0.05 具有统计学意义。

2 结果与讨论

AST/ALT 比值，n=7，***p<0.001，****p<0.0001；（c）分别取小鼠的肝脏和胰脏，（d）进行组织切片与HE 染色，组织切片的放大倍数均为400 倍。

2.1 尾静脉注射AAL诱导C57BL/6小鼠肝脏损伤

对C57BL/6 小鼠静脉注射AAL（2.5 mg/kg），在处理后的0 h、6 h、9 h 三个时间点通过眼球采血，其血清用于检测转氨酶活性，同时处死小鼠取其肝脏做石蜡组织包埋、切片及HE 染色。结果如图1a、1b所示，AAL 处理6 h 后，ALT 的测定值升高了134 倍，AST 的测定值升高了23 倍。处理9 h 后，ALT 的测定值升高了94 倍，AST 的测定值升高了19 倍。6 h组和9 h 组中的AST 与ALT 比值均小于1，提示AAL的处理可能引起非酒精性脂肪肝疾病。与对照组相比，AAL 处理6 h 和9 h 的C57BL/6 小鼠肝脏均出现肉眼条件下明显的肝损伤表征，包括肝脏淤血变暗和肿大；另外脾脏有变黑、肿大和淤血的现象（图1c）。在6 h和9 h 两个实验组之间，肝脏与脾脏的肉眼观察变化差异不明显。从肝脏组织HE 染色结果（图1d）可见，正常肝脏组织肝细胞以中央静脉为中心放射状排列形成肝板，相邻肝板之间的空隙为肝窦，是肝小叶内血液流通的管道。AAL 处理6 h 后，肝脏组织肝窦内出现红细胞淤积，肝实质细胞皱缩，连接消失，与周围的细胞脱离，大量肝细胞开始空洞化，坏死区还可见大量淋巴细胞、中性粒细胞等免疫细胞浸润。9 h 组的肝脏组织的肝窦红细胞淤积、肝细胞空洞化及免疫细胞浸润的程度减弱。

图1 尾静脉注射AAL 诱导C57BL/6 小鼠肝脏损伤 Fig.1 Tail intravenous injection of AAL induced liver injury in C57BL/6 mice

凝集素是一类广泛存在于真核细胞和细菌、病毒、真菌中的蛋白质或糖蛋白，能够保护或促进肝损伤。高剂量的槲寄生凝集素在小鼠模型中表现出致死性，低剂量的槲寄生凝集素具有肝脏毒性，并诱导血清AST 和ALT 显著升高[12]。接骨木果实中的核糖体灭活凝集素Ebulin f在年老小鼠模型中表现出致死活性，诱导包括肝脏坏死等消化器官的衰竭[13]。巴西青香木叶提取物及凝集素在荷S180 小鼠模型中均有抗肿瘤活性，但会引起肝脏组织的液泡化和脂肪肝[14]。另外，常用于诱导小鼠肝脏损伤模型的刀豆蛋白Con A（concanavalin A）也是一类凝集素[15]。结合研究结果提示，在食用或使用天然产物作为药物时，要注意其中是否有凝集素成分，探讨其安全使用剂量。

2.2 AAL 调节C57BL/6 小鼠肝脏细胞因子的mRNA 表达

检测C57BL/6 小鼠在尾静脉注射AAL 后6 h 和9 h肝脏组织五种细胞因子IL-10、IL-33、IL-27、IFN-γ和TNF-α的mRNA 表达变化情况。如图2 所示，与对照组相比，AAL 处理6 h 和9 h 组的肝脏IL-10、IL-33、IL-27、IFN-γ和TNF-α的mRNA 表达水平都显著升高（p<0.001）。6 小时组中，细胞因子的表达分别升高到25.14 倍（IL-10）、4.62 倍（IL-33）、5.14 倍（IL-27）、16.51 倍（IFN-γ）、28.10 倍（TNF-α）。9 小时组中，细胞因子的表达分别升高到7.60倍（IL-10）、3.22倍（IL-33）、1.52 倍（IL-27）、12.78 倍（IFN-γ）、10.99 倍（TNF-α）。

图2 AAL 调节C57BL/6 小鼠肝脏细胞因子的mRNA 表达 Fig.2 AAL regulated mRNA expression of cytokines in the liver of C57BL/6 mice

肝脏细胞因子的表达水平与肝损伤机制密切相关。肝损伤上调了IL-10 表达水平，增强巨噬细胞的吞噬功能，促进肝脏损伤的修复[16]。另一方面，肝脏中的巨噬细胞被IFN-γ诱导活化为M1，分泌TNF-α、IL-1β和IL-12，促进肝细胞凋亡和肝纤维化[17]。同时，肝损伤后高表达的IL-27 促进炎症反应，进而上调TNF-α和IL-6 的表达水平[18]。IL-33 在不同的肝脏损伤模型的作用机制不同，这可能与不同的免疫病理类型相关。在病毒性肝炎模型中，IL-33 通过Th2 细胞/IL-13/STAT6 诱导免疫抑制性中性粒细胞的发挥肝脏保护作用[19]。外源性IL-33 给药处理降低Con A 诱导的肝损伤小鼠的IFN-γ和TNF-α表达水平，减轻肝脏炎症[20]；在Con A 诱导的肝损伤小鼠模型中，活化的CD8+T 细胞会损伤肝细胞，后者表达的IL-33 促进淋巴细胞IL-5 等炎症因子分泌[21]。另外在对乙酰氨基酚诱导的肝损伤小鼠模型中，阻断IL-33 后影响肝脏炎症因子的释放从而减轻肝脏损伤[22]。研究结果表明AAL 诱导小鼠肝损伤后，细胞因子IL-10、IL-33、IL-27、IFN-γ和TNF-α均参与肝损伤机制。

2.3 NKT 细胞和CD8+T 细胞参与了AAL 诱导C57BL/6 小鼠的肝脏损伤

为探究AAL 诱导C57BL/6 小鼠肝损伤的作用机制，通过分离肝窦单个核细胞结合流式细胞术，检测尾静脉注射AAL 后的C57BL/6 小鼠肝脏各类免疫细胞的变化情况。AAL（2.5 mg/kg）尾静脉注射C57BL/6小鼠，0 h、6 h、9 h 分离小鼠肝脏的单个核细胞，使用anti-CD3、anti-NK1.1 和anti-F4/80 荧光抗体染色结合流式细胞仪检测，通过设门（图3a、b），统计T细胞（CD3+T）、NKT 细胞（CD3+NK1.1+T）、Kupffer细胞（F4/80+）和NK 细胞（CD3-NK1.1+）占肝脏单个核细胞比例。结果表明，与对照组相比，6 h 组和9 h组小鼠肝脏T细胞比例由27.92%显著升高到45.95%和47.86%（p<0.05），NKT 细胞的比例由2.46%显著升高到6.36%和6.17%（p<0.05），而Kupffer 细胞和NK 细胞的比例没有显著改变（图3c）。

进一步用anti-CD3、anti-CD4 和anti-CD8 荧光抗体染色结合流式细胞仪检测，通过设门（图3d、e），统计CD4、CD8 T 细胞占单个核细胞的比例，以反映T 细胞亚群的变化。结果表明，与对照组相比，6 h 组小鼠肝脏CD8+T 细胞比例由17%显著升高到27.15%（p<0.05），而CD4+T 细胞的比例没有明显的改变（图3f）。

图3 注射AAL 后NKT 细胞和CD8+T 细胞数量的变化 Fig.3 The changes in number of NKT cells and CD8+T cells after AAL injection

正常肝脏中30%为非肝实质细胞，包括约50%的内皮细胞、20%的Kupffer 细胞和25%的淋巴细胞等[23,24]。在Con A 诱导的急性肝损伤模型中，Kupffer细胞、CD4+T 细胞、Treg 细胞和NKT 细胞均参与其中[25-27]，且CD4+T 细胞是主要的效应细胞。这与AAL主要诱导CD8+T 细胞增多不同。另一关于AAL 诱导小鼠肝损伤的研究发现，AAL 可诱导T 细胞和NKT细胞的数量比例增加[28]，这与该研究结果是一致的。

2.4 尾静脉注射AAL 促进了小鼠肝脏CD8+T细胞的活化

CD69 是T 淋巴细胞和天然杀伤细胞（NK 细胞）活化的表面标志[29,30]，为进一步探索小鼠肝脏免疫细胞在AAL 处理后的活化情况。AAL（2.5 mg/kg）尾静脉注射C57BL/6 小鼠，0 h、6 h、9 h 分离小鼠肝脏的单个核细胞，用anti-CD3、anti-NK1.1、anti-CD4、anti-CD8 和anti-CD69 荧光抗体染色结合流式细胞仪检测，结果表明，与对照组相比，6 h 组的CD69+T细胞的比例由10.02%显著升高到18.28%（p<0.01），CD69+CD8+T 细胞的比例由 5.96%显著升高到16.20%（p<0.01），CD69+CD4+T 细胞的比例由2.27%显著降低到1.58%（p<0.01）。9 h 组的CD69+NKT细胞的比例由6.95%降低到4.62%（p<0.05）。以上结果说明AAL 促进小鼠肝脏的T 细胞和CD8+T 细胞的活化。

CD8+T 细胞是肝脏中主要的T 细胞群，CD8+T细胞的激活与急性甲型肝炎的肝损伤程度相关[31]，并且是非酒精性脂肪性肝炎的主要调节细胞[32]。另一方面，急性肝炎的程度受CD8+T 细胞功能的调节，但是不受其细胞寿命变化的影响[33]。传统观点认为CD4+T 细胞而非CD8+T 细胞在Con A 诱导小鼠的急性肝损伤中发挥重要作用[34]。最新的一项ConA 的研究发现，在Rag2 缺陷小鼠转移T 细胞模型中，CD8+T细胞通过IL33 的释放介导肝脏的严重损伤[21]。本研究中，AAL 诱导小鼠急性肝损伤后使CD8+T 细胞的活化显著增加，且IL33 的mRNA 水平显著升高，提示在AAL 诱导C57BL/6 小鼠肝脏损伤中CD8+T 细胞的重要作用。未来仍需要通过封闭细胞试验进一步验证CD8+T 细胞参与肝脏毒性的作用机制。

图4 注射AAL 促进小鼠肝脏免疫细胞的活化 Fig.4 The AAL injection promoted activation of liver immune cells in mice

3 结论

杨树菇凝集素AAL 尾静脉注射C57BL/6 小鼠，诱导血清ALT 和AST 水平显著增加，肝脏组织中出现炎症细胞浸润、肝细胞坏死空洞。其作用机制是上调肝脏NKT 细胞和CD8+T 细胞的数量，活化CD8+T细胞，诱导肝脏细胞因子IL-10、IL-33、IL-27、IFN-γ和TNF-αmRNA 的表达增加。