5株梯棱羊肚菌菌丝生长特性研究*

刘 娜，宋 莹，吕立涛，张 敏

（辽宁省农业科学院食用菌研究所，辽宁省食用菌优质栽培重点实验室，辽宁 沈阳 110161）

羊肚菌（Morchellaspp.），隶属子囊菌门（Ascomycota） 盘菌亚门（Pezizomycotina） 盘菌纲（Pezizomycetes） 盘菌亚纲 （Pezizomycetidae） 盘菌目（Pezizales） 羊肚菌科 （Morchellaceae） 羊肚菌属[MorchellaDill.ex Pers.,Neues Mag.Bot.1:116(1794)][1]。因其浓郁而不腻的风味、清爽脆嫩的口感、丰富的营养价值和显著的保健功效被世人所喜爱。梯棱羊肚菌（Morchella importuna）是羊肚菌属下黑色羊肚菌类群，是近年来我国驯化、推广栽培的菌种[2]，在东北已经形成日光温室小规模化栽培模式。然而，由于在该生产过程中仍存在很多亟待解决的问题，使得梯棱羊肚菌产量不稳定，故对其菌丝体培养特性的报道较少。羊肚菌菌丝体的生长、菌核的形成除需适宜的营养基质外，还必须在特定的外界条件下，才能使其从营养生长转向生殖生长，形成子实体原基，进而发育成正常的子实体。这些外界条件包括温度、pH、碳源、氮源等，不同品种的羊肚菌菌丝在不同条件下，生长状态有所不同，生长速度、长势、色泽等菌落形态特征存在差别。同时，作为子实体培育先决条件的菌核，其形成时间、数量和分布方式也受到明显影响。因此，探索不同菌株菌丝的最佳培养温度、pH、碳源、氮源非常必要[3]。2017年7月，在辽宁省农业科学院食用菌研究所试验室，通过对5株梯棱羊肚菌菌丝在不同温度、pH和碳源、氮源条件下的生长情况进行研究，分别筛选出培养5株梯棱羊肚菌菌丝体最适培养温度、pH、碳源、氮源，为其菌种生产及规模化栽培提供理论依据和参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

供试菌株由辽宁省农业科学院食用菌研究所提供，详情见表1。

表1 供试菌株Tab.1 Tested strains of Morchella importuna

1.1.2 培养基配方

基础PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂 20 g，水 1 000 mL。

1.2 试验方法

1.2.1 温度试验

用已灭菌的打孔器（直径6 mm）均匀截取活化好的菌丝体组织块，接种于基础PDA培养基，分别置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃恒温避光培养，每个温度设置3个重复，观察记录[4]。

1.2.2 pH试验

采用基础PDA培养基，分别用10%氢氧化钠和10%盐酸调节其 pH，设为 4、5、6、7、8、9、10、11、12，每处理3次重复。各培养基分别接种菌丝体组织块，置于20℃恒温避光培养，记录生长情况[5]。

1.2.3 碳源试验

以基础PDA培养基中20 g葡萄糖的含碳量为标准，分别以相等含碳量的蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、乳糖代替基础PDA培养基中的葡萄糖，其他成分不变，对比菌丝生长情况[6]。

1.2.4 氮源试验

以基础PDA培养基中2 g蛋白胨的含氮量为标准，分别以相等含氮量的尿素、氯化铵、硝酸铵、酵母粉代替基础PDA培养基中的蛋白胨，其他成分不变，对比菌丝生长情况[6]。

1.3 数据记录与分析

观察并记录菌丝生长速度、长势和长满培养皿的时间[7-9]。以菌丝长满培养皿的时间为最终培养时间，以接种块为中心用刻度尺测量菌落直径（cm），随机测量3次，取平均值。记录菌核形成时间，培养7 d后观察菌核分布方式[10]。菌丝日均生长速度（V，cm·d-1）公式为：

式中：R表示菌落直径（cm）；D表示培养时间（d）。

2 结果与分析

2.1 不同温度下各菌株菌丝和菌核生长特性

不同温度下各菌株菌丝生长速度见表2。

由表2可知，在PDA培养基上，5个供试菌株在温度5℃～30℃范围均能生长。菌丝生长速度随着温度升高而加快，在温度25℃时菌丝生长最快，之后随着温度的升高，菌丝生长速度变慢。不同温度梯度各菌株菌核特征见表3。

表2 不同温度下5株羊肚菌菌丝生长速度Tab.2 Mycelial growth rate of 5 Morchella importuna at different temperature

表3 不同温度下各菌株菌核特征Tab.3 Sclerotium growth characteristics of Morchella importuna at different temperature

表3中，菌核分布方面，分散表示菌核分布在以接种点为中心，向四周分散；聚集表示菌核全部聚集在接种点周围。由表3可知，5个菌株在不同温度下，菌核形成时间及菌核生长情况不同。温度的高低对菌核的形成有影响，在温度5℃条件下，5个菌株培养7 d均不能形成菌核；在温度10℃和15℃条件下，菌株003、菌株004和菌株005培养7 d均不能形成菌核；在温度20℃和25℃条件下，5个菌株都能形成菌核；在温度30℃条件下，除了菌株003外，其他菌株都能形成菌核。从菌核形成时间来看，温度越低菌株001和菌株002菌核形成越慢，温度越高菌核形成越快；其他3个菌株除了菌株004在温度20℃下96 h（4 d） 可形成菌核外，其他菌株都是120 d（5 d） 形成菌核。从菌核分布来看，菌株001和菌株002在温度10℃～30℃条件下，除了菌株002在温度10℃条件下菌核分布为分散型外，这两个菌株在其他条件下菌核分布都为聚集型；菌株003、菌株004和菌株005的菌核分布都为分散型。从菌核密度来看，菌株001在温度10℃和30℃下，菌核密度小于在其他3个温度下的菌核密度；菌株002在温度15℃和30℃下菌核密度小于在其他3个温度下的菌核密度。从菌核颜色来看，菌株001和菌株002的菌核颜色随着温度升高，颜色逐渐加深；其他3个菌株都为乳白色。

2.2 不同pH处理各菌株菌丝及菌核生长特性

不同pH处理各菌株生长速度见表4。

表4 不同pH处理各菌株生长速度Tab.4 Mycelial growth rate of Morchella importuna at different pH value

由表4可知，在PDA培养基上，5个供试菌株在pH为4～12范围内均能生长，在不同pH下生长速度差异明显。菌株001、菌株004和菌株005在pH为4～7范围内，随着pH的升高菌丝生长速度逐渐加快；在pH为8～12范围内，随着pH的升高菌丝生长速度逐渐减慢。菌株002和菌株003在pH为4～8范围内，随着pH的升高菌丝生长速度逐渐加快；在pH为9～12范围内，随着pH的升高菌丝生长速度逐渐减慢。不同pH处理各菌株菌核特征见表5。

表5 不同pH下各菌株菌核特征Tab.5 Sclerotium characteristics of Morchella importuna at different pH

（续表 5）

表5中，菌核分布方面，分散表示菌核分布在以接种点为中心，向四周分散；聚集表示菌核全部聚集在接种点周围。由表5可知，在pH为12时，5个菌株均不能形成菌核。从菌核形成时间看，pH为4时，5个菌株菌核形成需要120 h（5 d）；在pH为6～10时，5个菌株菌核形成需要96 h（4 d）。 从菌核分布看，菌株001和菌株002在pH为4～7时菌核分布为分散型，在pH为4～7时菌核分布为聚集型；菌株003、菌株004和菌株005在pH为4～11时菌核分布为分散型。从菌核密度看，5个菌株在pH为4、10、11时，菌核密度相对较小，其他pH条件下菌核密度各有差异，密度不同。从菌核颜色看，菌株001和菌株002在pH为4～7时菌核颜色浅黄，在pH为8～11时菌核颜色黄色，说明随着pH升高，这两个菌株菌核颜色逐渐变深；菌株003在pH为4～11时菌核颜色浅黄；菌株004在pH为4～8时菌核颜色乳白色，pH为9时菌核浅黄色，pH为10～11时菌核黄色，说明随着pH升高，菌株菌核颜色逐渐变深；菌株005在pH为8时菌核颜色乳白色，pH为4～7和9时菌核浅黄色，pH为10和11时菌核黄色，说明此菌株受pH影响，菌核颜色变化差异大。不同碳源条件下各菌株生长速度见表6。

表6 不同碳源对羊肚菌菌丝生长速度的影响Tab.6 Effect of different carbon source on mycelial growth rate of Morchella importuna

由表6可知，菌株001在不同碳源下菌丝生长速度大小为：葡萄糖＞乳糖＞麦芽糖＞淀粉＞蔗糖；菌株002在不同碳源下菌丝生长速度大小为：乳糖＞淀粉＞蔗糖＞葡萄糖，麦芽糖；菌株003在不同碳源下菌丝生长速度大小为：乳糖＞葡萄糖＞淀粉＞麦芽糖＞蔗糖；菌株004在不同碳源下菌丝生长速度大小为：葡萄糖＞蔗糖＞乳糖＞淀粉，麦芽糖；菌株005在不同碳源下菌丝生长速度大小为：葡萄糖＞麦芽糖＞蔗糖＞淀粉＞乳糖。不同碳源条件下各菌株菌核特征见表7。

表7 不同碳源羊肚菌菌核形成情况Tab.7 Effect of different carbon source on sclerotium characteristica of Morchella importuna

表7中，菌核分布方面，分散表示菌核分布在以接种点为中心，向四周分散；聚集表示菌核全部聚集在接种点周围。由表7可知，菌株001和菌株003在以乳糖为碳源的培养基中培养7 d不能形成菌核；菌株002在以淀粉和麦芽糖为碳源的培养基中培养7 d不能形成菌核；菌株004在淀粉和乳糖培养基中不能形成菌核；菌株005在5种碳源培养基中均能形成菌核。从菌核形成时间来看，5个菌株在以葡萄糖为碳源的培养基中，形成菌核时间一样都是96 h（4 d），在其他可形成菌核的培养基里菌核形成的时间不同。从菌核分布来看，菌株001、菌株002和菌株005的菌核分布为分散型；菌株003和菌株004在5种碳源里，除了菌株003在以淀粉为碳源的培养基中是分散型，在其他可形成菌核的碳源培养基里都是聚集型。从菌核密度来看，菌株001和菌株002在5种碳源里形成菌核较少，对其他3个菌株的菌核多少影响更明显。从菌核颜色上来看，5个菌株在以淀粉为碳源的培养基中菌核颜色为乳白色，在其他形成菌核的碳源里颜色深浅不同。不同氮源条件下各菌株生长速度见表8。

表8 不同氮源对羊肚菌菌丝生长速度的影响Tab.8 Effect of different nitrogen source on mycelial growth rate of Morchella importuna

由表8可知，5个梯陵羊肚菌菌株在5种不同氮源上均能生长，但菌丝生长速度差异明显。菌株001在不同氮源下菌丝生长速度大小为：蛋白胨＞氯化胺＞硝酸铵＞酵母膏＞尿素；菌株002在不同氮源下菌丝生长速度大小为：酵母膏＞蛋白胨＞氯化胺＞硝酸铵＞尿素；菌株003在不同氮源下菌丝生长速度大小为：蛋白胨＞硝酸铵＞酵母膏＞氯化胺＞尿素；菌株004在不同氮源下菌丝生长速度大小为：硝酸铵＞蛋白胨＞氯化胺，酵母膏＞尿素；菌株005在不同氮源下菌丝生长速度大小为：硝酸铵＞氯化胺，酵母膏＞蛋白胨＞尿素。5个梯棱菌株不同氮源下菌核特征见表9。

表9 不同氮源对梯棱羊肚菌菌核形成的影响Tab.9 Effect of different nitrogen source on sclerotium characteristics of Morchella importuna

表9中，菌核分布方面，分散表示菌核分布在以接种点为中心，向四周分散；聚集表示菌核全部聚集在接种点周围。由表9可知，在硝酸铵、氯化胺和尿素为氮源的培养基中培养7 d均不能形成菌核。从菌核形成时间上来看，5个菌株在蛋白胨和酵母膏为氮源的培养基中菌核的形成时间不同。从菌核分布上来看，菌株001和菌株002在蛋白胨和酵母膏为氮源的培养基中菌核分布为聚集型，菌株003、菌株004和菌株005的菌核分布各有不同。从菌核密度上来看，5个菌株在形成菌核的氮源里多数菌核数量较多，只有菌株003在酵母膏培养基中菌核数量较少，菌株005在蛋白胨培养基中菌核数量较少；从菌核颜色上来看，5个菌株菌核都为黄色。

3 结论

温度在5℃～30℃范围内，5株梯棱羊肚菌菌丝均能生长，但生长速度差异明显。从菌丝生长速度和菌核形态方面综合比较：菌株F011菌丝生长适宜温度为20℃～25℃、pH为6～7、碳源为葡萄糖和麦芽糖，氮源为蛋白胨和酵母膏；菌株Q菌丝生长适宜温度为20℃～25℃、pH为8～9、碳源为葡萄糖和蔗糖，氮源为蛋白胨和酵母膏；菌株301菌丝生长适宜温度为20℃～25℃、pH为7～8、碳源为葡萄糖和淀粉，氮源为蛋白胨和酵母膏；菌株85菌丝生长适宜温度为20℃～25℃、pH为6～7、碳源为葡萄糖和蔗糖，氮源为酵母膏；菌株W16H2菌丝生长适宜温度为20℃～25℃、pH为6～7、碳源为葡萄糖、蔗糖和麦芽糖，氮源为蛋白胨和酵母膏。

在相同条件下，不同羊肚菌菌株所形成的菌核，在颜色、数量方面存在很大的遗传差异性[11]；菌株不同，其菌核的形成特征也不同[12]。而试验中，存在一些比较极端的条件，导致5个菌株中只有少数菌株才能产生菌核，或5个菌株均不产生菌核的情况。在温度为5℃的条件下，可能由于菌丝未长满培养皿，所以并未形成菌核；当pH为12时不产生菌核；乳糖和淀粉影响菌核形成；在5种氮源中，只有蛋白胨和酵母膏培养基中菌株形成菌核，其他3种氮源对菌核形成影响较大。上述分析仅从现象上进行了描述，关于其产生机理还需继续研究。