一株高漆酶活性树舌灵芝降解木质素条件的优化*

刘晓丹，王 霞，杨祥波，叶 飞

（吉林农业科技学院生物工程学院，吉林 吉林 132101）

农作物废弃秸秆中含有大量难以被利用的木质素资源，同时木质素也是影响反刍动物瘤胃微生物消化的因素之一[1]。因此，如何提高微生物对木质素的降解效率成为近年来研究开发的热点。据报道，木质素降解能力较强的微生物多为白腐真菌、软腐真菌和褐腐真菌[2-4]。此类真菌通过合成漆酶（laccase，Lac）、锰过氧化酶 （manganese peroxidase，MnP） 和木质素过氧化物酶 （lignin peroxidase，LiP）[3，5]等一系列同功酶的方式发挥作用。

灵芝不仅具有较高的药理活性，还具有高效降解木质素的潜在特性[6]。目前国内外对灵芝属的研究多集中在木质素降解酶系及单一酶发酵条件的分析方面，而关于木质素降解应用的研究相对较少。在前期分离到的1株树舌灵芝（Ganoderma applanatum） 的基础上，分析该菌株的降解酶系，进一步研究其对木质素的降解条件，为提高微生物对木质素的降解能力提供参考，同时对未来如何应用农作物废弃物资源进行生物转化或饲料加工等领域的研究具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

树舌灵芝菌株由吉林农业科技学院生物工程学院微生物实验室分离、鉴定并保存。

1.1.2 培养基

PDA培养基及种子培养基配方参考文献[7]。

愈创木酚显色培养基：含0.04%愈创木酚的PDA培养基。

产酶培养基[8]：小麦麸皮20.0 g·L-1、豆粕2.0 g·L-1、葡萄糖 20.0 g·L-1、KH2PO43.0 g·L-1、MgSO41.5 g·L-1。

木质素降解培养基[3]：木质磺酸钠2.0 g·L-1、葡萄糖 0.5 g·L-1、豆粕 2.0 g·L-1、KH2PO43.0 g·L-1、MgSO41.5 g·L-1、CuSO40.375 g·L-1。

1.2 方法

1.2.1 树舌灵芝降解木质素的定性分析

将活化后的树舌灵芝菌株接种于愈创木酚显色培养基上，28℃培养，12 h后观察是否形成有色圈，测定菌落直径d1及有色圈直径d2，计算d1/d2的比值[9]，初步分析树舌灵芝降解木质素的特性。

1.2.2 树舌灵芝中木质素降解酶的动态分析

将活化好的菌株，用打孔器取3块直径为5 mm的菌饼，接种至种子培养基中，28℃、120 r·min-1培养5 d后即为种子液，转接至产酶培养基中进行发酵培养。每隔2 d取5 mL发酵液，10 000 r·min-1离心8 min，取上清液测定酶活。

木质素降解酶系的酶活测定：漆酶的活性测定采用ABTS法[10]；锰过氧化物酶（MnP） 的活性测定参考Rogalski[11]的方法；木质素过氧化物酶（LiP）的活性测定采用藜芦醇法[12]。

1.2.3 木质素降解率的测定

配制不同浓度梯度的木质磺酸钠标准溶液，于280 nm波长下测定OD值，并绘制标准曲线[3]。木质磺酸钠浓度与吸光值间的线性回归方程为y=0.028 8x-0.028 3，相关系数R2=0.998 6。

种子液按2%接种于降解培养基中，28℃、120 r·min-1培养 9 d。发酵液经 10 000 r·min-1离心 8 min，上清液经适当稀释后，测定OD280值，计算木质磺酸钠含量[13]。

木质素降解率（P1，%）计算公式为：

式中：P1表示木质素磺酸钠降解率，C表示发酵后木质素磺酸钠的含量。

1.2.4 不同因素对树舌灵芝降解木质素的影响

将制备的种子液接种到降解培养基中，以木质素磺酸钙为底物，发酵培养9 d后，测定木质素的降解率。以降解率为指标，分别考察降解培养基中不同氮源、氮源浓度、底物浓度、培养温度及初始pH对树舌灵芝降解木质素的影响。

1.2.5 正交试验优化降解条件

在单因素试验结果的基础上，进行 L9(34)正交试验进一步优化木质素降解条件。水平因素见表1。

表1 正交试验设计Tab.1 Design of orthogonal test

1.2.6 验证试验

按照正交试验优化的最适降解条件进行验证，进行平行3次试验，计算木质磺酸钠的平均降解率。

2 结果与分析

2.1 产漆酶树舌灵芝的定性分析

树舌灵芝在愈创木酚平板中的显色分析见图1。

图1 树舌灵芝在愈创木酚平板中的显色分析Fig.1 Colorimetric analysis of Ganoderma applanatum on plates supplemented with guaiacol

树舌灵芝菌饼接种于显色培养基上，第2天即形成淡红色有色圈，初步判断该菌株可以产漆酶。第5天后菌落直径达到最大，有色圈颜色明显加深，呈棕红色。进一步测定菌落直径和有色圈直径并计算d1/d2的比值，比值为 0.568～0.734，小于1.000时，初步判定该菌株可以选择性降解木质素[14]。

2.2 树舌灵芝中木质素降解酶系的动态分析

对木质素降解酶的测定结果如图2所示。

图2 树舌灵芝木质素降解酶系分析Fig.2 Ligninolytic enzymes analysis of Ganoderma applanatum

由图2可知，树舌灵芝Lac酶活明显高于LiP和MnP；发酵培养7 d时Lac酶活达到峰值，为735.2 U·L-1。其次是LiP，而MnP的活性相对较低。LiP和MnP酶活均在第5天检测到峰值，分别为254.6 U·L-1和142.7 U·L-1。由此推断树舌灵芝木质素降解过程中漆酶可能发挥关键作用。

2.3 不同因素对树舌灵芝木质素降解率的影响

2.3.1 不同氮源对树舌灵芝木质素降解率的影响

本研究分别选取无机氮源和有机氮源各3种，分析氮源对木质素降解率的影响。结果如图3所示。

图3 氮源种类对树舌灵芝木质素降解率的影响Fig.3 Effect of nitrogen source species on lignin degradation rate of Ganoderma applanatum

由图3可知，以豆粕作为氮源时，木质素降解率达到32.22%，降解效果最好。后续试验中选择豆粕为主要氮源。

2.3.2 不同氮源浓度对树舌灵芝木质素降解率的影响

适宜的氮源浓度有利于提高木质素降解率，对不同氮源浓度的试验结果见图4。

图4 氮源浓度对树舌灵芝木质素降解率的影响Fig.4 Effect of nitrogen source concentration on lignin degradation rate of Ganoderma applanatum

由图4可知，氮源浓度为2.5 g·L-1时，木质素降解率最高。氮源浓度较高时，木质素降解率略低于氮源浓度较低时的降解率。

2.3.3 不同底物浓度对树舌灵芝木质素降解率的影响

不同底物浓度对树舌灵芝木质素降解率影响的试验结果见图5。

图5 底物浓度对树舌灵芝木质素降解率的影响Fig.5 Effect of substrate concentration on lignin degradation rate of Ganoderma applanatum

由图5可知，当底物浓度为2 g·L-1时，降解效果最好，木质素降解率达到35.73%。当底物浓度大于5 g·L-1后，降解率迅速下降。分析原因可能是底物浓度升高后，随着培养时间的延长，发酵液逐渐粘稠，会降低菌体对营养及氧气的吸收[15]，进一步抑制菌体分泌降解酶系，进而影响木质素的降解。

2.3.4 不同培养温度对树舌灵芝木质素降解率的影响

不同培养温度对树舌灵芝木质素降解率的影响试验结果见图6。

图6 培养温度对树舌灵芝木质素降解率的影响Fig.6 Effect of culture temperature on lignin degradation rate of Ganoderma applanatum

由图6可知，温度一方面影响菌株的生长代谢，另一方面影响木质素降解速度。在30℃条件下，树舌灵芝木质素降解率最高。温度高于30℃时，木质素降解率显著降低，与相对高温下降解酶容易变性、失活有关。

2.3.5 不同初始pH对树舌灵芝木质素降解率的影响

不同初始pH对树舌灵芝木质素降解率的影响试验结果见图7。

图7 初始pH对树舌灵芝木质素降解率的影响Fig.7 Effect of initial pH on lignin degradation rate of Ganoderma applanatum

由图7可知，该菌株在pH 6.0～9.0之间，对木质素均有很好的降解效果。在pH为9.0时，木质素降解率仍能达到18.92%。pH过高或过低时，木质素降解率均明显降低。

2.4 树舌灵芝木质素降解条件的优化

树舌灵芝木质素降解条件的优化的正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果Tab.2 Orthogonal test results

由表2可知，树舌灵芝降解木质素的最适发酵条件为氮源浓度2.5 g·L-1，底物浓度3.0 g·L-1，初始pH 6.0，发酵温度28℃。极差分析结果表明，4个因素对木质素降解率的影响大小依次为氮源浓度＞底物浓度＞初始pH＞培养温度。各因素对试验显著性的影响如表3所示。

由表3可知，氮源浓度对木质素降解率的影响显著 （P＜0.05）。

表3 正交试验显著性分析结果Tab.3 Significance analysis results of orthogonal test

2.5 验证试验

根据正交试验结果，选择最优降解条件，进行3次平行验证试验，得到优化条件下树舌灵芝木质素平均降解率，结果见表4。

表4 验证试验结果Tab.4 Verification test results

由表4可知，树舌灵芝木质素降解率的平均值为44.72%，表明该发酵条件下木质素降解率较高，重复性好，符合最佳降解条件。

3 讨论

灵芝属菌类普遍具有高效降解木质纤维素的特性，在农作物秸秆的生物降解、造纸废水的处理、饲料加工等领域具有广阔的应用前景[6]。目前灵芝属菌类的研究主要包括高产菌株的选育、产漆酶条件的优化及酶生物学特性分析等基础研究[16]，应用研究中多集中在染料脱色方面，关于木质素降解的应用研究相对较少。

真菌在不同生长阶段分泌的木质素降解酶活性不同[17]，有文献报道[18]食用菌在菌丝体时期漆酶活性较高，因此本研究采用液态发酵培养菌丝进行降解特性的分析。不同灵芝菌株的木质素降解酶活性差异很大，直接影响到木质素的降解率。本研究中对树舌灵芝发酵培养分泌的木质素降解酶系分析表明，Lac酶活性明显高于LiP和MnP；发酵培养7 d检测到峰值，为735.2 U·L-1。刘禹等[19]分析了相同培养条件下，灵芝属7个不同菌种漆酶活性间存在差异，其中有柄树舌与信州灵芝的漆酶活性显著高于其他菌种，有柄树舌在第3天时即可检测到高漆酶活性，信州灵芝在第6天达酶活峰值。王茂成等[20]对8种不同食用菌产酶情况进行分析，发现木耳和灵芝产酶活性最高，培养到第3天时，检测到灵芝中Lac、LiP和MnP的酶活分别为508.6 U·L-1、112.3 U·L-1和 112.6 U·L-1。

影响菌株合成和分泌木质素降解酶种类和活性的关键因素是培养体系中的碳源、氮源的种类、浓度[17]及培养条件。陶君等[21]研究发现，灵芝的最适产漆酶条件为麦芽糖3%、酵母浸粉0.25%、pH 6.0、培养温度25℃。潘志恒等[8]发现，树舌灵芝发酵产漆酶最佳培养基为小麦麸皮20 g·L-1、豆粕2 g·L-1、硫酸铜 0.625 g·L-1、香兰素 0.037 5 g·L-1。孙海鑫[22]研究发现，杂色云芝产漆酶培养基最优组合为马铃薯 200 g·L-1、葡萄糖 10 g·L-1、麸皮 10 g·L-1、黄豆粉7 g·L-1。吴佳慧[23]研究表明，最适合灵芝K-17菌株产漆酶的营养成分为玉米粉、麸皮和花生壳。而Stajic等[24]研究表明，灵芝产LiP和MnP的最佳氮源是蛋白胨，Lac和MnP的最佳氮源NH4NO3。Batool等[25]对灵芝菌株IBL-05进行产酶条件的优化时发现，选择葡萄糖和尿素作为碳源、氮源，发酵培养6 d时，LiP酶活最高。王书超等[26]在对树舌灵芝产漆酶发酵条件进行优化和分析其主要降解酶系的基础上，在木质素降解特性试验中选择以豆粕2.0 g·L-1作为氮源，额外添加0.5 g·L-1葡萄糖补充碳源，以满足菌丝体生长的需要。

本研究中，在验证树舌灵芝能够选择性降解木质素的基础上，采用液态发酵对树舌灵芝的降解酶系进行分析，并通过正交试验确定了液态发酵条件下树舌灵芝降解木质素的最佳条件。目前课题组正在开展树舌灵芝降解玉米和水稻秸秆的研究，以期为将来树舌灵芝在农作物秸秆资源的生物转化及饲料加工生产等方面的应用提供参考资料。