基于ITS序列分析黑龙江东部地区市售黑木耳品种遗传多样性*

李睿瑞，荆瑞勇，杨 帆，郭嘉贵，李 磊，任墨涵，赵行健，王丽艳

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江 大庆 163319）

黑木耳（Auricularia auricula-judae） 是自然分布并广泛栽培的食用菌之一[1]，属于担子菌门（Basidiomycota） 层菌纲 （Hymenomycetes） 木耳目（Auriculariales） 木耳科 （Auriculariaceae） 木耳属（Auricularia）[2]。我国黑木耳栽培历史有1 000多年，经长期的人工驯化，其遗传背景非常复杂[3-4]。黑龙江东宁县是我国最大的黑木耳批发集散地，收集与批发来自全国各地的黑木耳干品。在该地区调查不同黑木耳菌种，研究其遗传背景，可避免盲目引种，或因菌种名称混乱带来的问题[5-6]，对本地引种筛选工作具有重要意义。

目前，黑木耳品种鉴定方法除传统形态学调查外，更准确的是基于PCR的DNA指纹技术及酯酶同工酶法。路新彦等[7]研究发现酯酶同工酶、分子标记法及拮抗试验法得到的结果一致，但酯酶同功酶方法稳定性及可重复性不高，拮抗试验较直观，但需要辅助或补充其他试验才能更确切，因此分子标记的方法更加准确。分子标记方法有很多，包括PCR-RAPD （random amplified polymorphic DNA）[8-10]、ISSR （inter-simple sequence repeat）[11-13]及 ITS （internal transcribed spacer）[14-18]等，其中 ITS 方法应用较多[14-18]。刘华晶等[15]利用ITS序列对大兴安岭地区野生黑木耳菌株的亲缘关系进行研究发现，野生菌株遗传多样性优于栽培菌株。张丹等[16]对中国7个毛木耳菌株的ITS序列进行比较发现，供试6个菌株的ITS2区序列长度完全相同，整个ITS区共有11个变异位点，该分析结果支持传统的依据形态学进行的木耳属分类结果。张跃新等[14]对黑龙江地区8个野生黑木耳菌株和15个主栽黑木耳菌株的ITS序列进行分析，也发现野生菌株间遗传距离变化范围大于栽培菌株。钱雪婷等[18]分析秦巴山区44个黑木耳菌株的ITS序列聚为5个分支，部分菌株间同源性较高，甚至可能为同一个种，只有菌株耳268与其他菌株亲缘关系较远。

本研究对东宁县批发市场采集的11个黑木耳干品和牡丹江市售6个黑木耳试管斜面菌种的遗传多样性进行研究，通过对样品ITS区间进行测序和序列特征比对，构建系统进化树，以期为17种供试黑木耳的品种鉴定和遗传背景分析提供理论依据，为东宁县黑木耳种质资源信息库提供数据支撑，为当地黑木耳引种筛选奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试11份黑木耳干品收集于黑龙江省东宁县黑木耳批发市场，形态特征见表1；供试6份试管菌种购于牡丹江，详情见表1。

供试培养基为PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL；液体培养基：蔗糖 20 g、酵母粉 1 g、蛋白胨 1 g、MgSO4·7H2O 1.5 g，KH2PO41.0 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.0。

表1 供试黑木耳干品与菌株Tab.1 Tested Auricularia auricula-judae dried samples and strains

1.2 黑木耳菌种的组织分离及纯化培养

将供试黑木耳干品用无菌水泡发，用75%酒精冲洗表面，再用无菌水冲洗2次。切取0.5 cm见方的组织块在无菌条件下接种于PDA培养皿上，置于25℃恒温培养箱黑暗培养5 d～7 d。待组织块长出白色菌丝，将菌丝转接至PDA斜面试管培养基，于25℃恒温培养箱黑暗培养5 d～7 d后，同供试黑木耳试管菌种一起接种于液体培养基，于25℃、160 r·min-1条件下振荡培养7 d，获得的菌丝球用无菌蒸馏水冲洗后，在无菌条件下取1 g于2 mL离心管中，保存于-80℃冰箱中备用。

1.3 黑木耳菌种DNA的提取

采用改良CTAB法从菌丝体中提取DNA，具体操作如下：将2%的CTAB缓冲液700 μL和巯基乙醇7 μL加入2 mL离心管中混匀，置于65℃水浴锅预热备用。从超低温冰箱中取出菌丝各1 g～2 g，迅速在液氨中充分研磨。研磨好的样品装入上述2 mL离心管中，混匀后放入65℃水浴锅水浴40 min，每隔10 min颠倒混匀1次。取出离心管加入700 μL氯仿-异戊醇，混匀20 min，静置5 min，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液至新的2 mL离心管。加入700 μL苯酚-氯仿-异戊醇，混匀20 min，静置5 min，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液至新的2 mL离心管。加入异丙醇700 μL，颠倒混匀至白色絮状沉淀出现，冰浴30 min，12 000 r·min-1离心10 min得到沉淀的DNA。弃上清，用70%乙醇清洗沉淀2次，用无水乙醇清洗1次。风干，加入50 μL的TE buffer溶解沉淀。

1.4 黑木耳ITS片段的PCR扩增及克隆测序

使用真菌ITS通用引物[17]ITS 1（5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’） 和 ITS 4 （5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’） 进行PCR扩增，反应体系为 50.0 μL：Buffer 5.0 μL，dNTPs 5.0 μL，50.0 pmol·L-1的 ITS 引物各 0.5 μL，Taq 酶 1.0 μL，Template 1.0 μL，ddH2O 37.0 μL。PCR 反应条件为：94℃预变性 5 min；94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸30 s，循环35次；72℃延伸5 min，16℃保存。取3 μL的PCR产物用于琼脂糖凝胶电泳检测，其余PCR产物经胶回收试剂盒（Bio Gel Extraction Kit，BioFlux，北京） 回收目的片段。将获得的DNA片段连接至pEASY T1载体上，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，经PCR检测阳性克隆，各选取3个阳性克隆送至测序公司进行测序。

1.5 系统发育分析

测序获得的ITS序列经 NCBI网站 （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/） 上BLAST比对，与已发表的黑木耳ITS序列进行同源性分析；将所有测序获得的 ITS序列在日本 DNA数据库 （DDBJ）（http://www.ddbj.nig.ac.jp/）上Clustal W程序进行序列间相似性比较；采用MEGA 5.0软件构建邻接法系统发育树。

2 结果与分析

2.1 黑木耳菌株DNA提取、PCR扩增及克隆

电泳检测结果见图1。

由图1A可知，部分菌丝体DNA可获得明显的条带。经重复提取DNA，供试黑木耳干品均可获得明显的DNA条带。由图1B可知，以黑木耳DNA为模板、ITS 1/ITS 4为引物进行PCR扩增，获得PCR产物均在600 bp左右。由图1C可知，将PCR产物进行胶回收、克隆，以ITS 1/ITS 4为引物进行检测，每个样品的阳性克隆率均较高。

图1 菌丝体DNA（A）、PCR片段（B）和阳性克隆（C）检测Fig.1 Detection of mycelium DNA(A),PCR fragments(B)and positive clones(C)

2.2 黑木耳菌种ITS序列比对

供试黑木耳ITS序列BLAST比对结果见表2。

由表2可知，供试黑木耳ITS序列经测定，去除引物片段后发现，除8号菌株ITS序列长度为561 bp外，其他菌株ITS片段长度均为559 bp。BLAST比对结果显示，供试17株黑木耳的ITS序列主要与Auricularia auricula-judaeE53 （KT964886）、Auricularia auricula-judaeHMSK （HQ388371） 和Auricularia auricula-judaeYAASM3687（KM884970） 序列同源性最高，均达到99%～100%。其中，Auricularia auricula-judaeE53菌株序列由钱雪婷等人提交，Auricularia auricula-judaeHMSK菌株序列由刘华晶等人提交，Auricularia auricula-judaeYAASM3687菌株序列由赵永昌提交，但针对该菌株的研究报道均未见发表。

供试黑木耳菌株ITS序列在核苷酸水平上相似性比较结果详见表3。如表3所示，对供试黑木耳ITS序列进行相似性比对发现，供试黑木耳菌株的ITS序列间相似性在98%～100%；其中8号、13号、15号、16号黑木耳菌株的ITS序列相似性达到100%，证明这四种黑木耳菌株为同一菌株，只是市售品种名称不同。

2.3 黑木耳菌种的系统发育分析

供试17种黑木耳菌株的ITS序列进行系统发育分析结果见图2。

表2 供试黑木耳ITS序列BLAST比对结果Tab.2 BLAST results of tested Auricularia auricula-judae strains ITS sequences

表3 供试黑木耳菌株ITS序列在核苷酸水平上相似性比较结果Tab.3 Similarity comparison results of tested Auricularia auricula-judae strains ITS sequences at the nucleotide level

由图2可知，供试17种黑木耳菌株聚为一支，可分为7个类型，其中1号、10号和14号菌株为Type I；2号菌株为Type II；8号、13号、15号、16号与Auricularia auricula-judaeE53菌株为Type III；6号和12号菌株为Type IV；17号菌株为Type V；3号、4号、7号和9号为Type VI；5号和11号与Auricularia auricula-judaeHMSK菌株为Type VII。

3 结论

ITS是真菌核糖体rDNA中18S、5.8S和28S间非编码转录区，因其进化速率快，长度适宜，被广泛用于高等真菌种内变异或属内种间鉴定的分子标记[14-17]。近年来基于ITS序列对黑木耳菌种的鉴定报道较多[15-16,18]。

图2 基于ITS序列分析的供试黑木耳菌株系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of tested Auricularia auricula-judae strains based on ITS sequences analysis.

黑木耳的子实体形态特征是鉴别黑木耳菌种较直观的方法，但黑木耳栽培管理过程中有较多因素干扰黑木耳子实体的形成，如温度[19]、湿度、光照等，为更准确地了解黑木耳种质资源，为当地引入优良黑木耳菌种资源，基于ITS序列分析技术结合子实体特征分析可高效地筛选获得高产优质的黑木耳菌种。

本研究为调查黑龙江东部地区市售黑木耳种质资源，收集了东宁县黑木耳干品11种，结合牡丹江市售6种黑木耳试管菌种，通过组织分离、DNA提取、ITS序列扩增、测序及系统发育分析，发现供试17种黑木耳可分为7种类型，表明东宁县黑木耳批发市场黑木耳遗传多样性丰富。同时，研究结果发现，部分不同名品种的ITS序列进化距离相同，说明市售黑木耳菌种存在商品名不同但实际为同一品种的情况，市场品种名称较为混乱，这与王晗等[3]研究结果一致。刘华晶等[10]在研究黑木耳ITS序列时，测序得其长度在598 bp～784 bp，而本研究中供试黑木耳菌株的ITS序列在大部分为559 bp，可能因所采用的引物序列长度不同所致。以上结果为黑木耳种质资源调查及当地黑木耳引种提供理论指导。

由于东宁县黑木耳批发市场黑木耳干品较多，本研究采集的样品数量有限，在下一步研究中有必要扩大采样量，获得更多的黑木耳菌种资源。