低能离子注入诱变酿酒酵母菌胞外代谢产物的差异性分析

白巧秀，欧科，王婷，杨倩倩，刘静，李侃社，陈福欣*，毛培宏*

（1.西安科技大学化学与化工学院，陕西西安 710054）（2.新疆大学物理科学与技术学院，放射生态与离子束生物技术中心，新疆乌鲁木齐 830046）（3.陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安 710032）

代谢组学是功能基因组学的主要研究工具，与基因组学、转录组学和蛋白质组学一起共同构成系统生物学[1]。靶向/非靶向代谢物或生物标记物的定性和定量分析是代谢组学的重要研究目标之一[2]。微生物代谢组学就是通过对微生物代谢物进行定性与定量分析，来了解微生物的生理状态[3]，微生物代谢产物的变化与细胞所处内外环境密切相关，微生物生物体内环境的变化，更多的体现在代谢产物的变化上，其中的代谢轮廓分析对深入研究微生物特别是工程菌的工业化应用有重要的研究价值[4]。研究表明，细胞内与细胞外代谢产物的种类和含量受环境影响的程度是不同的，这也给代谢组学研究提出了新的挑战[5,6]。

酿酒酵母菌作为重要的工业微生物之一，营养需求简单，生长速度快，因此酿酒酵母菌是微生物代谢组学中的主要研究对象之一[7]。在前期研究中，课题组利用低能离子注入介导乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensis）基因组DNA 随机转化酿酒酵母菌，并获得了遗传稳定、醌类和萜类化合物含量显著提高的重组酵母菌N6076；通过转录组测序，初步比较了差异表达基因及相关功能[8]。GO 功能分析结果表明N6076新增了14 项生物学过程、2 项细胞组分和2 项分子功能；涉及1140 个差异表达基因。此外，代谢组学的研究表明，重组酵母菌的胞内代谢产物也存在明显的差异[9]。其中甲羟戊酸-5-磷酸和胱氨酸分别为两株酵母菌胞内的显著差异代谢产物。为了进一步研究酵母菌的完整的代谢途径，同时针对胞内外代谢产物的差异性进行系统比较；在前期研究工作的基础[10]，基于超高效液相色谱-飞行时间质谱法（UPLC-Q-TOF/MS）与代谢组学数据处理方法，对胞外的代谢提取物进行处理及分析，获得了重组菌株N6076 与原始菌株Kh08在不同发酵时期的胞外代谢差异，同时对两株酵母代谢通路进行分析，为进一步理解酵母菌胞内小分子化合物的代谢与重组酵母菌的进一步遗传改良和驯化提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

UPLC-Q-TOF/MS（Bruker maXis Q-TOF）超高分辨飞行时间质谱仪，德国Bruker 公司；超净工作台（SW-CJ-2FD），上海沪净医疗器械有限公司；立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-75KBS），上海申安医疗器械厂；台式高速冷冻离心机（Beckman Allegra 64R），美国beckman 公司；涡旋振荡器（Vortex1），德国艾卡公司；超低温冰箱（ThermoFisher 88700V），美国ThermoFisher 公司；全温振荡恒温摇床（HZQ-2），常州市仪都仪器有限公司；电子天平（岛津AUY220），日本岛津公司；甲酸、乙腈、甲醇（HPLC 级），天津市大茂化学试剂公司；葡萄糖，天津市大茂化学试剂公司。

1.2 菌株来源

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）N6076 来源于低能氮离子注入介导外源DNA 随机转化酿酒酵母Kh08 获得的遗传稳定的产醌类物质的重组酵母菌，由新疆大学物理科学与技术学院放射生态与离子束生物技术中心保存。

1.3 培养条件

YPD 斜面培养基：酵母膏10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、琼脂粉10 g、蒸馏水1000 mL。液体培养基：葡萄糖·H2O 80 g、蛋白胨10 g、酵母膏粉5 g、KH2PO41.50 g、MgSO4·7H2O 0.50 g，蒸馏水1000 mL，pH 自然。

1.4 实验方法

所有的实验器具及培养基均在121℃下灭菌30 min。将保存在甘油管中的菌株在平板上复苏，挑单菌落于YPD 斜面培养基上，并在30℃下培养48 h。将YPD 斜面培养基上培养48 h 的新鲜菌种置于4℃保存24 h 后接种至液体培养基中，置摇床150 r/min、28～30℃发酵96 h。

分别吸取培养0 h、48 h、96 h 的5 mL 酵母样品菌液，加入150 μL 的Vc 溶液保护液。在4℃环境下，5000 r/min 离心5 min，收集上清液。加入等体积的氯仿，剧烈震荡30 s，静置10 min。收集下层无色液体，放入2 mL 冻存管中，氮气常温吹干，置于-80℃下冷藏备用。测试时将胞外代谢产物复溶于200 μL 的溶液（乙腈:水=7:3）中，将样品在12000 r/min 条件下离心5 min 后再进行测试。

本研究设置3 个生物学重复，每个生物学重复的0 h、48 h、96 h 设置6 个技术重复。

1.5 色谱与质谱检测条件

UPLC-Q-TOF/MS 测试条件，色谱柱：C18（Waters BEH，50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：40℃；进样量：5 μL，流速：0.20 mL/min。流动相A 为V（乙腈）:V（水）=5:95+0.1%甲酸，流动相B 为乙腈+0.1%甲酸。梯度洗脱：0～2 min（100% A），2～3 min（100%～90% A），3～5 min（90%～60% A），5～10 min（60%～10%A）。离子源：ESI 正离子模式；毛细管电压：3500 V，离子源温度：200℃；气体流速设定为8 L/min，雾化气压力为4 bar。m/z扫描范围为50～1000。数据采集速率设置为0.20 s，延迟0.10 s。质量轴以甲酸钠为校准液。

1.6 数据分析

2 株酵母菌不同发酵时间的胞内代谢物通过UPLC-Q-TOF/MS 检测后的数据用Data Analysis 程序转换为CDF 格式，进行XCMS-Online 分析，分析结果导入SIMCA-P，利用PLS-DA 进行代谢物的鉴定。

2 结果与分析

2.1 酵母菌胞外代谢产物分析

偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）是多变量数据分析技术中的判别分析法，可以有效的对组间观察值进行区分，并且能够找到导致组间区别的影响变量。

在进行PLS-DA 分析时，0 h 代谢组样品为一组，48 h 与96 h 为一组。重组酵母菌N6076 代谢物（图1）与原始菌株Kh08代谢物（图2）均能在PLS-DA分布图中明显区分。并且N6076 代谢物与Kh08 代谢物均基本处于95%置信区间内，绿色圆形分别为0 h N6076 代谢物与Kh08 代谢物样本，其全部处于置信区间的左侧。蓝色圆形为48 h、96 h N6076 代谢物与Kh08 代谢物样本，主要分布在置信区间的右侧。两组样本几乎不重叠，都有各自的样本聚集区域，区分效果比较明显。说明两种菌株的0 h 代谢物样本与48 h、96 h 的代谢物样本均存在显著差异。

图1 重组酵母菌N6076 代谢物的PLS-DA 分布图 Fig.1 PLS-DA distribution map of the metabolites of recombinant yeast N6076

图2 原始菌株Kh08 代谢物的PLS-DA 分布图 Fig.2 PLS-DA distribution map of metabolites of original strain Kh08

同时得到了重组酵母菌N6076 代谢物（图3）与原始菌株Kh08 代谢物（图4）的载荷图。越靠近俩边的点表明其所代表的代谢物在该组中含量差别较大，而越靠近中间点表明该代谢物在两组中的差异越小。N6076 代谢物与Kh08 代谢物在PLS-DA 载荷图中均呈椭圆形，并且差异最大的部分分布在正负轴的两侧。

图3 重组酵母菌N6076 代谢物的PLS-DA 载荷图 Fig.3 PLS-DA loading diagram of the metabolite of recombinant yeast N6076

图4 原始菌株Kh08 代谢物的PLS-DA 载荷图 Fig.4 PLS-DA loading diagram of metabolites of original strain Kh08

200 次随机排列得出检验结果见图5 和图6。如图所示，重组酵母菌N6076 代谢物与原始菌株Kh08 代谢物PLS-DA 模型置换检验图的右侧点均高于左侧相同形状的点，表明模型稳定，无过拟合现象。Q2 通过交叉验证的测试数据计算得到，描述的是模型的预测能力，本模型的Q2 截距在0.1 左右，其为正值，有可能是生物样本的实际数量过少所致[11]。

图5 重组酵母菌N6076 代谢物的PLS-DA 模型置换检验图 Fig.5 PLS-DA model replacement test diagram of the metabolites of recombinant yeast N6076

图6 原始菌株Kh08 代谢物的PLS-DA 模型置换检验图 Fig.6 PLS-DA model replacement test diagram of metabolites of original strain Kh08

2.2 酵母菌胞外代谢差异分析

采用PLS-DA 模型的VIP 值（阈值>1）来进行差异代谢物的筛选。差异代谢物在HMDB 数据库中通过质荷比与库中物质进行比对，从而确定重组酵母菌N6076 代谢物（表1）与原始菌株Kh08 代谢物（表2）的差异代谢物结构信息。其中重组菌株N6076 的差异化合物为15 种（表1），原始菌株Kh08 的差异化合物为14 种（表2）。

表1 重组菌株N6076 差异性化合物 Table 1 Differential compounds of recombinant strain N6076

表2 原始菌株Kh08 差异性化合物 Table 2 Differential compounds of original strain Kh08

值得关注的是无论在重组菌株N6076还是原始菌株Kh08 中，吲哚-3-丙酸（IPA HMDB0002302）均为代谢产物中差异性较大的共同代谢物（或中间体），随后将结合代谢通路分析对该化合物进一步讨论。

采用Metaboanalyst（https://www.metaboanalyst.ca/）对重组菌株N6076 与原始菌株Kh08 鉴定得到的差异代谢物进行分析，将化合物对应的HMDB 号输入数据库比对，选择酿酒酵母（酵母）的通路分析数据得到代谢组视图（图9、图10）。其中每一个气泡代表一个通过通路富集分析得到的p值和通路拓扑分析pathway impact values 显示的匹配得到的代谢通路。气泡的颜色代表富集程度的大小即纵坐标p值，颜色越深表明富集程度越显著[12]。

图9 重组菌株N6076 代谢通路 Fig.9 Metabolic pathway of recombinant strain N6076

图10 原始菌株Kh08 代谢通路 Fig.10 Metabolic pathway of original strain Kh08

差异物热图（图7、图8）的结果显示，无论在重组菌株N6076 中，还是在原始菌株Kh08 中吲哚3-丙酸的浓度均最高，且48 h、96 h 浓度均高于0 h 重组菌株N6076 浓度。

图7 菌株N6076 热图 Fig.7 Heat map of strain N6076

图8 原始菌株Kh08 热图 Fig.8 Heat map of original strain Kh08

2.3 酵母菌胞外代谢通路分析

在重组菌株N6076 代谢通路中，主要涉及了Ether lipid metabolism（通路A，醚脂代谢）、Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchor biosynthesis（通路B，糖基磷脂酰肌醇（GPI）-锚定生物合成）、Pantothenate and CoA biosynthesis（通路C，泛酸和CoA生物合成）、Glycerophospholipid metabolism（通路D，甘油磷脂代谢）。影响较大的代谢通路为脂类代谢。醚脂是一类独特的甘油磷脂，它参与多种生物功能，包括调节细胞分化，影响细胞信号传导，通过其潜在的内源性抗氧化剂功能来降低氧化应激[13,14]。甘油磷脂是机体内含量最多的一类磷脂，构成生物膜，参与胞膜对蛋白质的识别和信号传导[15]。

表3 重组菌株N6076 相关代谢通路 Table 3 Relevant metabolic pathways of recombinant strain N6076

2.4 吲哚-3-丙酸可能代谢通路的分析

早期的研究发现，吲哚-3-丙酸是一类重要的植物生长激素，可被植物的根、茎、叶和花吸收，具有促进生根、座果等多种生理作用。此外，作为一种内源性的微生物次级代谢产物，吲哚-3-丙酸也具有较强的抗氧化活性[16]。并且与其它抗氧化物质不同的是，吲哚-3-丙酸在清除自由基的同时，不产生反应性和促氧化性的中间化合物[17,18]。因此，推测吲哚-3-丙酸在酿酒酵母的生长及衰老过程中也可能是关键的调控物质，对整个酵母菌种的驯化和筛选产生巨大影响[19]。

图11 是基于现有数据库推测的吲哚-3-丙酸代谢通路，图中浅蓝色表示这些代谢物仅作为富集分析的背景信息，并未被匹配到；红色表示代谢物在数据中具有显著性。当然，也有文献报道[20]，L-色氨酸可以通过特定的转氨反应和脱氨反应生成吲哚-3-丙酸，这一生化过程简单、明了，但是能否在酵母菌的代谢过程中发生该反应，还需要进一步研究。

图11 吲哚-3-丙酸可能的代谢通路 Fig.11 Possible metabolic pathways of IPA

3 结论

基于代谢组学的方法分别对重组菌株N6076与原始菌株Kh08 的不同时期胞外代谢产物进行分析，重组菌株N6076 筛选出14 种差异性代谢产物，原始菌株Kh08 筛选出15 种差异代谢物。其中吲哚-3-丙酸是两种菌株中共同的差异性代谢物。通路分析发现，差异性代谢物均涉及醚脂代谢、糖基磷脂酰肌醇（GPI）-锚定生物合成、泛酸和CoA 生物合成、甘油磷脂代谢。其中作为共同的差异代谢物吲哚-3-丙酸，基于已有的代谢通路分析，其可能与酵母中的L-色氨酸代谢有关，进一步的验证工作正在实验室中逐步开展。