聚乙烯醇-海藻酸钠-改性沸石固定化菌球降解氨氮的研究

孙 霞，刘 扬，张 虎，王 芳，郑福山

(1.山东江河湿地生态研究院，山东 济南 271100；2.中国水利水电科学研究院，北京100038； 3.湖南百舸水利建设股份有限公司，湖南 长沙 410007)

随着我国经济的快速发展和人们生活水平的提高，氨氮污染的来源越来越广泛[1-2]，含氨氮污水排入河流、湖泊，会导致鱼类等水生生物因缺氧而死亡。因此，有效控制水体中的氨氮含量是水污染治理的重点。

目前已报道许多硝化细菌具有良好的降解氨氮性能[3-4]，但是由于细菌个体微小，难于固液分离，易随水流流失，限制了其工业化应用。固定化技术将微生物细胞固定在载体内，解决了固液分离困难的问题，而且具有生物负载量大、稳定性高、不易造成二次污染等优势[5]。在固定化载体中，聚乙烯醇(PVA)软硬程度可调，柔韧性能良好，但其传质性能较差；海藻酸钠(SA)固定化成型方便，但其机械强度较差，易被微生物分解。当PVA和SA混合应用时，可避免固定化菌球的拖尾，改善PVA的黏附聚集等问题，但仍存在机械强度差、受水力冲击影响大等缺陷[6]。为此，研究者在PVA-SA混合载体中添加生物炭[7]、活性炭[8]及谷朊粉、聚丙烯纤维[9]等材料，来改善固定化菌球的性能。沸石具有较大的比表面积和发达的微孔结构，对氨氮有较高的选择吸附性[10]。用酸、碱、盐及高温等[11-13]方法对沸石进行改性处理，能大大提高沸石的吸附容量，增强对氨氮的去除能力。

目前，大规模应用固定化菌球还存在易破碎、发胀、活性丧失等缺陷。作者以PVA-SA为包埋载体，改性沸石为吸附载体，硝化细菌Acinetobactersp.DT12-3为目标菌，采用吸附-包埋联合固定化技术制备固定化菌球，探究包菌量、菌悬液浓度、固定化菌球投加量等因素对氨氮降解效果的影响，并评价固定化菌球的重复使用性，以期为固定化菌球技术处理氨氮提供参考。

1 实验

1.1 材料与试剂

模拟水(g·L-1)：葡萄糖0.1，酵母粉 0.01，三水乙酸钠 0.4，无水磷酸二氢钾 0.002，氯化铵 0.06，硝酸钾 0.02，氯化钠 0.05。

改性沸石：称取沸石(粒径40～60目，国药集团化学试剂有限公司)50 g，在500 ℃马弗炉中灼烧2 h，在干燥器中冷却，备用。

聚乙烯醇(PVA，聚合度1 788)，国药集团化学试剂有限公司；海藻酸钠(SA)，上海阿拉丁试剂有限公司。

1.2 菌株与培养基

硝化细菌Acinetobactersp.DT12-3由本实验室筛选所得，最适生长温度为30 ℃，最适pH值为7.2，培养12 h达到稳定期。

牛肉膏蛋白胨培养基(g·L-1)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，pH值7.2。

1.3 固定化载体性能的测定

传质性能测定：将一定量的固定化载体放入滴加了3滴亚甲基蓝溶液的50 mL蒸馏水中，室温静置24 h；以空白水为参比，在406 nm处分别测定放入和未放入固定化载体的亚甲基蓝水溶液的吸光度值OD406，OD406值越低说明固定化载体的传质性能越好。

溶胀率测定：将固定化载体烘干1 h后，称取一定量(W0)放入盛有碳酸氢钠缓冲溶液(pH值7.5)的烧杯中，于30 ℃恒温静置直至溶胀平衡；分别在第6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h时将固定化载体从溶液中取出，滤纸吸干表面水分后称重(Wt)，按下式计算溶胀率(SR,%)：

1.4 固定化菌球的制备

将保藏的硝化细菌Acinebactersp.DT12-3接种于牛肉膏蛋白胨培养基，30 ℃振荡培养至菌液OD600值为0.8～1.0。将菌液在10 000 r·min-1下离心5 min，菌体用无菌生理盐水洗涤2～3次，重悬成OD600值为1.5的菌悬液。称取一定量的改性沸石加入到菌悬液中，30 ℃、120 r·min-1下吸附0.5 h。

参照李卫东等[14]的方法，根据前期预实验结果，取PVA 10 g溶于90 mL 90 ℃无菌水中，充分搅拌至完全溶解；再加入SA 1 g继续搅拌至完全溶解，用水浴锅将包埋液控制在35 ℃，静置消泡后，将改性沸石和菌悬液投入到包埋液中，搅拌均匀，定容至100 mL；将制备好的固定菌液用注射器滴入2% CaCl2饱和硼酸溶液中交联24 h；将小球过滤取出，并用无菌生理盐水冲洗2～3次，得到形状稳定的固定化菌球，用滤纸吸干表面水分，4 ℃储存备用。

1.5 固定化菌球降解氨氮的影响因素

1.5.1 包菌量对氨氮降解效果的影响

按1.4方法，将培养菌液用无菌生理盐水重悬至OD600值为1.0，分别以1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的包菌量(菌悬液与包埋液的体积比)制备固定化菌球，将固定化菌球加入到模拟水中，在30 ℃、120 r·min-1下振荡培养，定时测定水样中的氨氮浓度，计算氨氮去除率。

1.5.2 菌悬液浓度对氨氮降解效果的影响

按1.4方法，将培养菌液用无菌生理盐水重悬至OD600值分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5(OD600值为1.5时浓度约为5×108CFU·mL-1)，在最佳包菌量条件下制备固定化菌球，将固定化菌球加入到模拟水中，在30 ℃、120 r·min-1下振荡培养，定时测定水样中的氨氮浓度，计算氨氮去除率。

1.5.3 固定化菌球投加量对氨氮降解效果的影响

在最佳包菌量和菌悬液浓度下制备固定化菌球，分别以5%、10%、15%、20%、25%、30%的投加量将固定化菌球加入到模拟水中，在30 ℃、120 r·min-1下振荡培养，定时测定水样中的氨氮浓度，计算氨氮去除率。

上述实验均设3个平行样，重复2次，结果取平均值。

1.6 固定化菌球的重复使用性检测

在最佳条件下制备固定化菌球，以25%的投加量加入到模拟水中，分别在120 r·min-1振荡条件下和静置条件下培养24 h；将固定化菌球取出，用无菌生理盐水洗涤1次，并用滤纸吸干表面水分再转入新的模拟水中，重复数次，每次观察并记录固定化菌球的状态，测定水样中的氨氮浓度，计算氨氮去除率。

1.7 分析方法

采用纳氏试剂分光光度法[15]测定氨氮浓度，计算氨氮去除率。

2 结果与讨论

2.1 改性沸石添加量对固定化载体性能的影响

前期预实验从成球的难易程度、粘连状况、弹性、稳定性方面评价，当PVA质量浓度为10%(g∶mL，下同)、SA质量浓度为1%(g∶mL，下同)，用2% CaCl2饱和硼酸溶液交联24 h时，得到的固定化菌球的性能最佳，平均直径为2.95 mm，圆形或近圆形，无拖尾，无粘连现象。PVA 分子中含有大量的亲水性羟基(-OH)，其交联主要靠-OH进行，PVA浓度越高，小球内部结构越致密，传质性能越差[16]；而PVA浓度过低时，载体交联效果差，菌体容易溢出。研究显示PVA质量浓度在8%～12.5%范围内[17-18]，成球效果较好。SA具有提高PVA机械强度、增大孔径和韧性的作用，随着SA浓度升高，稠度会增加，流动性变差，容易拖尾；而SA 浓度过低时， SA与Ca2+交联度低，不易成球，机械强度下降。研究显示SA适宜质量浓度<2%[19]。本研究发现，PVA质量浓度为10%、SA质量浓度为1%时，固定化菌球的成球效果较好。

沸石经高温改性，可去除沸石孔穴和通道中的有机物等杂质，沸石的比表面积、孔径及孔隙率增大，空间位阻变小，内扩散速率加快[12]，因此在固定化载体中添加改性沸石，能提高固定化菌球的传质性能和吸附性能。结果表明，当PVA-SA包埋载体中添加2%的改性沸石，固定化菌球的传质性能和溶胀性能最佳，氨氮去除率最高；添加改性沸石24 h后，OD406值显著降低，说明传质性能提高；但当改性沸石添加量>2%时，OD406值及氨氮去除率趋于平稳(表1)，表明添加量为2%时，改性沸石达到吸附饱和状态，继续增加添加量并不能提高传质性能和氨氮去除率。溶胀率是影响固定化菌球理化性质的重要因素，溶胀过程其实是菌球内部高分子网络结构伸缩的过程，添加2%改性沸石的固定化菌球在24 h后达到溶胀平衡。

表1 改性沸石添加量对固定化菌球性能的影响

2.2 包菌量对氨氮降解效果的影响(图1)

图1 包菌量对氨氮去除率的影响Fig.1 Effect of volume ratio of bacterial suspension to embedded liquid on removal rate of ammonia nitrogen

由图1可知，随着包菌量的减少，即菌悬液在包埋液中的比例减小，氨氮去除率降低。当菌悬液OD600值为1.0时，菌悬液和包埋液体积比为1∶1制备的固定化菌球对氨氮的去除效果最好，氨氮去除率达62.2%。

2.3 菌悬液浓度对氨氮降解效果的影响(图2)

图2 菌悬液浓度对氨氮去除率的影响Fig.2 Effect of bacterial suspension concentration on removal rate of ammonia nitrogen

由图2可知，随着菌悬液浓度的增加，氨氮去除率先升高后下降，当菌悬液浓度OD600值为1.5时，固定化菌球对氨氮的去除效果最好，氨氮去除率达68.6%。可能是由于随着菌悬液浓度的增加，固定在菌球内的菌体增加，因而对氨氮的降解能力增强；但是随着浓度继续增加，进入菌球内的菌体密度增大，由于竞争营养和溶氧，菌体无法较好地生长繁殖及代谢，导致氨氮去除效果下降。故，菌悬液最佳浓度OD600值为1.5。

2.4 固定化菌球投加量对氨氮降解效果的影响(图3)

图3 固定化菌球投加量对氨氮去除率的影响Fig.3 Effect of dosage of immobilized bacteria pellets on removal rate of ammonia nitrogen

由图3可知，随着固定化菌球投加量的增加，氨氮去除率先升高后下降，当投加量为25%时，氨氮去除率达到最高，为93.2%；当投加量增加到30%时，氨氮去除率下降至89.5%。分析原因认为，在一定投加量范围内，随着固定化菌球投加量的增加，提供的作用位点数量随之增加，因此氨氮去除率升高；而当固定化菌球投加量超过一定限度后，菌球密度增大，造成菌球内的菌体无法得到充足的养分和氧气，使其代谢变慢，有的甚至死亡，从而使得氨氮去除率下降。故，固定化菌球的最佳投加量为25%。

2.5 固定化菌球的重复使用性(图4)

图4 固定化菌球重复使用对氨氮去除率的影响

固定化菌球的重复使用性可以反映处理系统的稳定性，对实际应用十分重要。在120 r·min-1振荡条件下(图4a)，固定化菌球可重复使用6次(合计144 h)；随着重复使用次数增加，氨氮去除率逐渐下降；重复使用4次后，固定化菌球结构开始膨胀松散，但氨氮去除率仍达77.8%；随后，固定化菌球出现膨胀及破碎的现象愈发明显，重复使用6次后，约90%的固定化菌球出现破损，氨氮去除率由最初的92.7%降至70.3%。

在静置条件下(图4b)，固定化菌球可重复使用10次(合计240 h)；重复使用6次后，固定化菌球开始膨胀松散，但氨氮去除率仍达72.7%；重复使用10次后，约90%的固定化菌球出现破损，氨氮去除率降至58.5%。

由此可见，振荡条件促使菌球间相互碰撞，加速了菌球的松散破损，使用次数仅能维持6次，而静置条件下使用次数能增加到10次；但是两种使用条件下，氨氮去除率均随使用次数的增加而不同程度地下降，因此固定化菌球的稳定性及机械强度有待进一步提高。

3 结论

以聚乙烯醇-海藻酸钠-改性沸石为载体、自行筛选的硝化细菌Acinetobactersp.DT12-3为目标菌制备了固定化菌球。结果表明，在聚乙烯醇和海藻酸钠复合载体基础上添加2%的改性沸石，固定化载体的传质性能、溶胀性能最佳；当菌悬液与包埋液体积比为1∶1、菌悬液浓度OD600值为1.5、固定化菌球投加量为25%时，固定化菌球对氨氮的去除率可达93.2%；固定化菌球的重复使用性较好，在振荡条件下，固定化菌球可重复使用6次，在静置条件下，固定化菌球可重复使用10次，使用10次后氨氮去除率为58.5%。