祛痰止咳胶囊对慢性支气管炎模型大鼠的治疗作用机制研究

丁云录，南敏轮，李会影，欧喜燕，李晓兵，赫玉芳

（1.长春中医药大学附属医院，长春 130021；2.吉林省中医药科学院，长春 130012；3.长春中医药大学，长春 130117）

慢性支气管炎（chronic bronchitis，CB）根据临床表现，可将其归属于中医“咳嗽”“痰饮”及“喘证”等范畴。呼吸道疾病的发病过程中，呼吸道内可能存在活跃的损伤及修复机制，PMN 产生的许多介质在这一过程中起重要作用，是介导炎症反应的重要效应细胞，在机体非特异性免疫防御中起重要作用[1-2]。本研究通过建立大鼠慢性支气管炎模型，从PMN噬吞指数、血清 IL-8、TNF-α、NO 及肺组织SP 含量等方面探讨祛痰止咳胶囊治疗慢性支气管炎的可能机制，进一步确证祛痰止咳胶囊的作用靶点及治疗机制，为更好地应用于临床提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 动物 SPF 级SD 大鼠，雌雄各半，250～280 g，合格证号：SCXK-（吉）2018-0007，购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。

1.2 药品及试剂 祛痰止咳胶囊，性状：本品由党参、水半夏、芫花、甘遂、紫花杜鹃、白矾六味中药组方，制成硬胶囊，内容物为褐色颗粒的或粉末，味苦，批号：20180801，吉林省中医药科学院植物化学研究所研制提供。咳喘宁片（0.41 g×24片/盒，江西药都仁和制药有限公司产品，批号：20190310）。脂多糖（Sigma，批号：DH183-1）；SP、IL-8、TNF-α、NO 酶联免疫试剂盒（美国RD公司，批号：E20190501A）；伊红染色液、苏木素染色液（珠海贝索生物科技有限公司）；组织固定液（广州维格斯生物科技有限公司，批号：18121204）。主要仪器 BIO680 酶标仪（Japan BIO RAD 公司产品）；FACS Aria II 流式细胞仪（美国BD 公司）；XT-2000i 全自动五分类血细胞分析仪（日本希森美康医用电子有限公司）；Biofuge Stratos 台式高速冷冻离心机（德国贺利氏公司）；JB-3A 恒温磁力搅拌器（雷兹互感器上海有限公司）；IX71倒置荧光显微镜（日本OLYMPUS）；ZT-14V2 生物组织脱水机、YB-6LF 石蜡包埋机、YT-7FB 摊片机、YR-21 染色机（湖北亚光）；leica2255 切片机、leicaEG 1150C 冷台（德国徕卡）。

1.3 方法[3-6］

1.3.1 分组、造模及给药 SPF 级健康8 周龄SD 大鼠，48 只，雌雄各半，购入后，分笼饲养，使其适应环境1 周。随机分为正常对照组、CB 模型组、阳性对照药咳喘宁片组；祛痰止咳胶囊设高、中、低3 个给药剂量组。共6 组，每组8 只。采用烟熏联合气管内注射LPS 的方法复制CB 大鼠模型。制作CB 模型的5 组大鼠放置于有机玻璃烟熏箱中，用烟叶150 g，点燃对大鼠进行烟熏，每天上午、下午各1 次，每次30 min，持续30 d；正常对照组置于常规环境中饲养。慢性支气管炎组大鼠于第1、15 天给予气管内注入LPS，每只200 μg（1 mg/mL），正常对照组给予气管内注入等体积生理盐水。大鼠于造模第2天开始给药，分别灌胃给予祛痰止咳胶囊高剂量（1.26 g/kg）、中剂量（0.63 g/kg）、低剂量（0.315 g/kg）及咳喘宁片（1.48 g/kg）药品混悬液，正常对照组和模型组大鼠灌服蒸馏水，给药体积均为10 mL/kg，连续灌胃30 d。实验中密切观察动物的一般状态如体质量、毛色、精神状态等。

1.3.2 实验取材 实验第30 天，给药后1 h，麻醉大鼠，采血，1 mL 肝素抗凝，备用；余全血以3000 rpm，离心15 min，取上清液、待测。夹闭右侧主支气管，导入微型导管于气管隆突上约1 cm 处固定，采用生理盐水灌洗3 次，灌洗速度与回抽速度保持在1～2 mL/min，回收的支气管肺泡灌洗液，1500 rpm 离心5 min，取上清液备用。解剖胸腔，剪取肺组织以预冷4℃生理盐水冲洗，滤纸吸湿，称取约0.5 g，置于EP 管，待检；另取一组织块置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于病理检测。

1.3.3 指标检测 1）炎症因子检测，取血清，采用ELISA 法，按试剂盒说明书检测 IL-8，TNF-α，NO含量。2）PMN 噬吞指数的检测，采用流式细胞术，取各组大鼠抗凝全血，用流式细胞仪检测PMN 荧光强度的变化，计算PMN 吞噬率。3）支气管肺泡灌洗液中AM、NEU 及LYM 百分比检测，取制作好的支气管肺泡灌洗液（BALF），用全自动五分类血液细胞分析仪检测AM%、NEU%及LYM%。4）肺组织SP 测定，取大鼠肺组织0.5 g，冷生理盐水漂洗，滤纸吸湿，称质量，剪碎，加入9 倍4℃生理盐水1 mL，匀浆，3500 rpm 离心10 min，提取上清液，严格按试剂盒说明采用ELISA 法测定SP 含量。5）肺组织病理形态学检测，取固定好的肺组织切块，石蜡包埋、切片，常规HE 染色，观察肺组织的病理形态学改变。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0 统计分析软件对实验数据进行统计学分析。所列数据以均数±标准差（）表示。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较 实验期间，正常对照组大鼠整体情况较好，无咳嗽、气喘等症状，饮食正常，活动灵敏，皮毛光亮，精神状态较好，体质量增长正常。模型组造模后7 d，活动后出现咳嗽喘息、呼吸困难等症状，口鼻流出黏液性分泌物，反应略迟钝，精神不佳，饮食减少，皮毛萎黄无光，体质量减轻。祛痰止咳胶囊各组大鼠经给药治疗后上述症状均有不同程度减轻。

2.2 各组大鼠肺组织SP 含量与PMN 噬吞指数比较 见表1。

表1 各组大鼠肺组织SP 含量与PMN 噬吞指数比较（，n =8）

表1 各组大鼠肺组织SP 含量与PMN 噬吞指数比较（，n =8）

注：与模型对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

2.3 各组大鼠血清中TNF-α、IL-8 和NO 含量比较 见表2。

表2 各组大鼠血清中TNF-α、IL-8 和NO 含量比较（，n =8）

表2 各组大鼠血清中TNF-α、IL-8 和NO 含量比较（，n =8）

注：与模型对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

2.4 各组大鼠支气管肺泡灌洗液AM、NEU 及LYM百分比比较 见表3。

表3 各组大鼠支气管肺泡灌洗液AM、NEU 及LYM 百分比比较（，n =8） %

表3 各组大鼠支气管肺泡灌洗液AM、NEU 及LYM 百分比比较（，n =8） %

注：与模型对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

2.5 肺组织病理检测结果 正常组大鼠肺内支气管与肺泡组织内未见炎细胞浸润，肺内气道上皮未见增生增厚；肺泡上皮未见充血，未见炎细胞渗出；未见肺泡融合与扩张。模型组大鼠肺内气道上皮可见增生增厚，肺内支气管周围可见深染的淋巴细胞为主的炎细胞聚集浸润，肺泡组织内可见炎细胞渗出，间质内毛细血管可见充血，局部可见肺泡融合与扩张。祛痰止咳胶囊1.26、0.63、0.315 g/kg 3 个剂量组均可以不同程度的减轻肺内炎症反应、减轻肺内病理形态的改变、增加肺组织的通气量和气体交换的能力。见图1。

图1 肺组织病理检测结果

3 讨论

在炎症反应过程中，PMN 通过表面模式识别受体与相关分子模式作用而得到激活，然后其受体与表达在血管内皮上的配体相互作用进行迁徙，通过吞噬作用和脱颗粒作用对病原体及损伤组织进行清除[7]。由此可知，当机体中的相关炎症因子处于上升时，机体可能产生一些炎症反应，如机体呼吸道支气管内出现炎性分泌物，上皮细胞增厚甚至脱落，继而出现咳嗽、气喘等症状。在生理浓度下，肺组织P 物质（SP）可舒张肺血管，增强血管通透性及增加血流量，但高浓度下，SP 则使舒张的肺血管发生收缩反应，SP 水平升高可引起气道平滑肌收缩，气道黏膜腺体分泌增强，导致炎性浸润[8-9]。本实验中祛痰止咳颗粒能明显降低慢支大鼠PMN 吞噬指数、SP 含量，继而减轻模型大鼠的炎症反应，达到缓解临床症状的作用。祛痰止咳胶囊有效抑制炎症因子TNF-α、IL-8 的释放，提高NO含量，显著改善大鼠慢性支气管炎症状，从而抑制气道炎性反应，具有减轻CB 大鼠气道炎症的作用。

本研究结果表明，祛痰止咳胶囊可以改善大鼠慢性支气管炎一般症状及肺组织病理情况；降低慢支大鼠PMN 吞噬指数、肺组织SP 含量，减少支气管及肺组织中中性粒细胞、炎性介质和细胞因子浸润，对控制气道炎症有较好的疗效。