基于多指标测定结合化学计量学的防风饮片质量评价

郭骏骐，张 淼，曹文正，于 澎，高红梅

（长春中医药大学药学院，长春 130117）

中药饮片系指在中医药理论指导下，根据辨证施治及调剂、制剂的需要，将中药材加工炮制成具有一定形状、规格的制成品[1]。作为直接原料药，饮片的质量至关重要[2]。多组分含量测定[3]、指纹图谱一致性评价[4]、化学计量学[5]等多种模式被广泛应用于中药原料及其相关产品的质量评价中。关于饮片等级划分的依据，多以外观性状结合化学成分含量为主。此外，基于成分-生物活性的评价指标也在饮片分级研究中得到应用[6-8]。防风为伞形科植物防风Szposhnikvia divaricata(Turcz.) Schischk.未抽花茎的干燥根，具有祛风解表、胜湿止痛、止痉之功效[9]。目前关于药材的等级标准只在《七十六种药材商品规格标准》中有收载，指标比较单一[10]。研究[11-13]依照不同的分类依据和分级方法，建立了对于防风的不同质量评价标准。本研究选取不同批次的防风饮片为研究对象，对饮片外观性状及内在质量中的多个指标进行考察，并进行统计学分析，对防风饮片的质量进行全面评价，筛选表征内在质量的外观性状指标，采用聚类分析对所选饮片进行等级划分，以期为防风饮片的质量和等级研究提供合理依据。

1 材料

1.1 仪器与试剂 仪器：LC-2030型高相液相色谱仪，日本岛津公司；Hypersil ODS2 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm），大连依利特分析仪器有限公司；FA1204B型万分之一电子天平，上海精密科学仪器有限公司；AB135-S型十万分之一分析天平，瑞士梅特勒－托利多公司；3NH-TS6010 台式分光测色仪，深圳市三恩时科技有限公司；标康SL01-22 数显游标卡尺（杭州标康科技有限公司）。试剂：升麻素苷对照品，上海源叶生物科技有限公司，批号Y24S6H3805，纯度98%；5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品，上海源叶生物科技有限公司，批号P05M8F35478，纯度98%。甲醇为色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司，批号 185366；乙腈为色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司，批号 186341；水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

1.2 样品 本研究收集的30 批防风饮片，经长春中医药大学蔡广知副教授鉴定均为伞形科植物防风Szposhnikvia divaricata（Turcz.）Schischk.的干燥根的炮制加工品。其中，来自安国市一方药业有限公司的产于河北的药材批号是18120203、CP17051901、18110606；安国市聚药堂药业有限公司的产于内蒙的药材批号是1805006、1803001、1809002；安国市誉林药业有限公司的产于吉林的药材批号是180301、180902、180503；安国祁安药业有限公司的产于河北的药材批号是180403、181102、181201；安徽省金芙蓉中药饮片有限公司的产于内蒙的药材批号是03-19010101、180101、02-19010101；河北仁心药业有限公司的产于内蒙的药材批号是13017024、13018003、13017029；安国市同義中药饮片有限公司的产于河北的药材批号是18040047、19010002、18110154；河北安国振宇药业有限公司的产于河北的药材批号是190101、171201、181202；河北祁新中药颗粒饮片有限公司的产于内蒙的药材批号是20170902、20181201、20180501；安国市祁澳中药饮片有限公司产于内蒙的药材批号是1711541111、1803541113、1805541132。共30 批，编号是1-30。

2 方法及结果

2.1 防风饮片外观性状参数测定

2.1.1 形态学测定 防风饮片为圆形或椭圆形的厚片，每批样品随机选取3组，每组100个饮片作为测量对象，以饮片外周最宽处两端的距离作为直径，测量并记录，并计算每批样品的平均直径。结果见表1。

2.1.2 颜色测定 1）测色模式，反射光；2）测色空间，采用L*、a*、b*色空间，其中L*代表亮度，a*代表红-绿色，b*代表蓝-黄色，E*ab 代表总色差，公式为E*ab=（L*2+a*2+b*2）1/2；3）测定径，4 mm；4）观察视野，10°；5）观察光源，D65 光（代表自然日光，色温度6504 k），光源为CIE（国际照明委员会）认可。取防风饮片细粉适量，在D65 光、A 光（代表白炽灯光，2856 k）光源下分别测定颜色，其他参数设定同上，每份样品平行测定3 次，取平均值。结果见表1。

表1 防风饮片外观性状测定结果

2.2 浸出物测定 照醇溶性浸出物测定法《中国药典》2020 版四部通则2201 项下的热浸法测定[15]，用乙醇作溶剂。结果见表2。

2.3 指标性成分含量测定 按《中国药典》2020 版一部防风项下含量测定方法进行测定，测定结果见表2，对照品及供试品图谱见图1。

表2 浸出物及指标性成分含量测定结果 %

图1 混合对照品（A）和供试品（B）HPLC 图

2.4 相关性分析 采用SPSS 22.0 软件对防风饮片直径、颜色（L*、a*、b*、E*ab）、浸出物含量及升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷含量进行相关性分析。结果见表3。

表3 相关性分析结果

2.5 主成分分析（PCA）以防风饮片的直径、颜色（L*、a*、b*、E*ab）、浸出物含量及升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷含量为变量，进行主成分分析。计算特征值及方差贡献率，以特征值＞1为标准，提取到2 个主成分，累计方差贡献率达到80.765%，可以代表样品的大部分信息，结果表明不同产地的样品之间有较大差异。详细结果见表4、表5。

表4 主成分分析特征值及方差贡献率 %

表5 主成分分析因子载荷矩阵

图2 防风饮片PCA 得分图

2.6 正交偏最小二乘法判别分析（OLPS-DA）以防风饮片的直径、颜色（L*、a*、b*、E*ab）、浸出物含量及升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷含量为变量，导入SIMCA 14.1 软件进行正交偏最小二乘法判别分析。在构建的OLPS-DA 模型中，累计解释能力参数RX2cum 和RY2cum 分别为0.724 和0.878，预测能力参数Q2cum 为0.785，表明模型的稳定性和预测能力较好，可用于样品差异的分析。由OLPS-DA得分图可知，与主成分分析结果相似，30 批样品能够被明显地区分开，见图3。绘制变量重要性投影图（variable importance in projection，VIP），以VIP 值>1为度，筛选关键变量。在所测定的所有指标中，浸出物（VIP=1.80）、L*（VIP=1.62）及E*ab（VIP=1.45）均大于1，可以认为在2 组样品差异产生中发挥重要作用。见图4。

图3 防风饮片OLPS-DA 得分图

图4 防风饮片各指标的VIP 值

2.7 防风饮片等级划分 初步选择直径、L*及E*ab3个指标参与防风饮片的等级划分，采用SPSS 22.0 软件，采用组间联接法，以欧式平方距离为测度，对30批样品进行进行系统聚类分析和K-均值聚类分析。由图5 可知，当聚类距离为15 时，所有样品被分为2 类，与PCA 分析及OLPS-DA 分析结果相似。其中FF-4～FF-6、FF-16～FF-18、FF-25～FF-30 等12 个样品被聚为一类，其余18 个样品被聚为另一类。见图5。根据K-均值聚类分析结果，可初步将30 批防风饮片划分为2 个等级。其中，一等防风饮片：直径≤8.4cm，L*≤45.49，E*ab ≤60.27。二等防风饮片：直径为8.4～10.6 cm，L*为45.49～54.19，E*ab 为60.27～67.03，见表6。按照最低定级原则，在所研究的30 批防风饮片中，无一等品；二等品有14 批（FF-4～FF-6，FF-9，FF-16～FF-9、FF-25～FF-30），其中仅FF-9 的药材产地为吉林，FF-9 的药材产地为河北，其余二等防风饮片的药材产地均为内蒙古。剩余的16批饮片均为统货。分级结果经过独立样本t检验，所划分等级样品质量有显著性差异（P＜0.01），表明分级依据合理、可靠。

图5 防风饮片聚类分析图

表6 防风饮片最终聚类中心

3 讨论

本研究结果表明，防风饮片的直径与其内在含量有显著的负相关关系。有学者发现，防风中4 种色原酮含量与根的直径呈明显的负相关[14]。本研究旨在寻找防风饮片中能够表征内在质量的外观性状，将其作为指标参与等级划分。结果表明，直径以及颜色中的L*、E*ab 与内在质量相关性较大，可作为防风饮片分级研究的重要参考依据。

本研究对不同批次防风饮片的外观性状指标和内在质量指标进行检测，并结合化学计量学方法，对所测内、外指标进行分析。结果表明饮片间的差异主要是因为饮片来源药材的产地不同。因此，对不同批次防风饮片的分析，揭示了饮片质量与其来源药材的产地具有一定的相关性，可为防风饮片质量评价以及防风药材种植基地选择提供依据。