芪参地黄颗粒质量标准的建立

王艺璇，孙 尧，王 健，成光宇，张洪铭，解生旭，郑明善*

（1.延边大学生物教研室，吉林 延吉 136200；2.长春中医药大学附属医院实验中心，长春 130117；3.吉林省中医药科学院植化室，长春 130012）

“芪参地黄颗粒”为拟研制开发的治疗重症肌无力的中药复方新药，由我院王健教授提出，他本人担任吉林省高校“创新团队发展计划”团队带头人，长白山学者特聘教授等。王健教授将学术与临床经验相结合，别具一格的以“禀赋”和“虚损”立论指出痿证的病机关键，提出了病机关键为“脾肾亏虚，脑髓不足”，治疗方法为“健脾益气补髓法”。制剂由黄芪、党参等十七味中药材组成。方中黄芪、党参为君药，具有益气壮阳、健脾润肺的功效，共奏扶正补脾益气之功；白术、枸杞子、巴戟天、黄精、山药助君药补气健脾补血生津，生地黄、狗脊、炙甘草祛风除湿，以上八者共为臣药；当归具有养血和营，协君药补气养血，地龙、钩藤二药合用增强熄风通络之功，陈皮调中、燥湿、痰湿使药物补而不滞，五者共为佐药；柴胡、升麻、葛根三者相配伍，协助君药以升提下陷之中气，担任佐使。本实验运用TLC 法对QSDH 中黄芪、党参、枸杞子、狗脊、当归、陈皮、葛根进行鉴别，并用HPLC 法测定黄芪甲苷的含量来控制QSDH 的质量，为其质量标准的制定奠定基础。

1 仪器与材料

LC-2010C型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；KQ -300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；分析天平万分之一FA2004N 天平 YUEPING 上海越平科学仪器（苏州制造有限公司）；十万分之一 METTLER TOLEDO AG245 瑞士；GOODLOOK-100型薄层色谱成像系统（上海科哲生化科技有限公司）；Milli -Q（MERC KMILLIPORE）；蒸发光散射检测器（ELSD，Alltech）。对照品：黄芪甲苷（批号：110781-20166，97.4%）、橙皮苷（批号：110721-201617，96.1%）、葛根素（批号：110752-201816，95.4%）以上对照品均来自于中国食品药品检定研究院。芪参地黄颗粒（批号：20191201/20191202/20191203），吉林省中医药科学院的制剂室提供；HPLC 定量分析中使用的乙腈、水均为色谱级，TLC 定性实验中使用到的化学试剂均为分析级。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 黄芪鉴别 取QSDH 约3 g，缓缓加入20 mL量的甲醇，加热并用冷凝管回流1 h，得到的滤液加于100～120 目的中性氧化铝柱（5 g，内径为10～15 mm）上，用40%甲醇洗脱，用量为100 mL，将洗脱液收集，然后蒸干，用30 mL 的水使蒸干物溶解，拿20 mL 量的正丁醇（水饱和）摇晃2次，归并正丁醇液再用水洗涤2 次（每次20 mL），留下正丁醇液蒸干，蒸发后的干物质滴0.5 mL 甲醇使其溶解，成为供试品溶液。拿一些量的黄芪甲苷对照品，与甲醇混合制成1 mL/mg 溶液，作对照品溶液。按照薄层色谱法试验[1]，在同一块高效G 上点2 种溶液每种4 μL，用甲醇-三氯甲烷-水（8:13:2）的下层溶液展开，拿出，挥干后喷1%香草醛硫酸乙醇溶液，105℃下加热，结果显示斑点清晰可见。被测颗粒色谱中，白光下显示和对照品色谱同位置上一样的蓝紫色斑点，见图1。

图1 黄芪 TLC 鉴别

2.1.2 党参鉴别 取QSDH约1 g，加25 mL量的甲醇，经过30 min 的超声处理，滤过，干燥，残渣用15 mL量的水溶解，过 D101型大孔吸附树脂柱（内径为1.5 cm，柱高为10 cm），拿50 mL 量的水洗脱，丢弃水液，再加50 mL50%浓度的乙醇洗脱，混合洗脱液，蒸发干，滴1 mL 的甲醇溶解，配成供试溶液。另取党参对照药材1 g，用上面方法配成对照药材溶液。按照薄层色谱法试验[1]，在同一块高效G 上点2 种溶液，每种5 μL，用甲醇-三氯甲烷-水（7:13:2）的下层溶液展开，拿出，放干，喷现配的1:1 的显色剂2%三氯化铁溶液-1%铁氰化钾溶液。被测颗粒色谱中，白光下显示和对照品色谱同位置上一样颜色的斑点，见图2。

图2 党参 TLC 鉴别

2.1.3 枸杞子鉴别 取QSDH 约1 g，加35 mL 量的水，经过15 min 加热煮沸，放冷，滤过，加15 mL 量的乙酸乙酯振摇提取，留下乙酸乙酯液，浓缩成1 mL 作供试品溶液。另拿枸杞子对照药材1 g，用上面方法配对照药材标准溶液。按照薄层色谱法试验[1]，在同一块高效G 上点2 种溶液，每种5 μL，用乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸（3:2:1）展开，拿出，挥干，被测颗粒色谱中，紫外光灯（365 nm）下显示和对照药材色谱同位置上一样颜色的荧光斑点，见图 3。

图3 枸杞子 TLC 鉴别

2.1.4 狗脊鉴别 取QSDH 约2 g，加50 mL 量的甲醇后经超声处理30 min，滤过，蒸干，滴1 mL 甲醇溶成供试品溶液。另取狗脊对照药材粉末2 g，用上面方法配对照药材溶液。按照薄层色谱法试验[1]，在同一块高效G上点2种溶液，每种4 μL，做条状，用乙酸乙酯-甲苯-三氯甲烷-甲酸（6:3:5:1）展开，拿出，挥干后喷现配的2%三氯化铁溶液-1%铁氰化钾溶液（1:1），让斑点显现清楚。被测颗粒色谱中，白光下显示和对照品色谱同位置上一样颜色的斑点，见图4。

图4 狗脊 TLC 鉴别

2.1.5 当归鉴别 取QSDH 约15 g，加30 mL 量的水溶解，离心，用乙酸乙酯萃取，取上清液2 次，每次20 mL，归并乙酸乙酯层，蒸干后加1 mL 甲醇溶成供试品溶液。另取当归对照药材5 g，加20 mL 量的甲醇，在进行30 min 的超声，滤过，蒸发滤液，加20 mL 量的水溶解，用乙酸乙酯萃取3 次，10 mL/次，混合乙酸乙酯层，蒸发后滴1 mL 量的甲醇配成对照药材溶液。按照薄层色谱法试验[1]，在同一块高效G上点2种溶液，每种5 μL，用正己烷-乙酸乙酯（4:1）溶液展开，取出，晾干，被测颗粒色谱中，紫外光灯（365 nm）下显示和对照药材色谱同位置上一样颜色的荧光斑点，见图5。

图5 当归 TLC 鉴别

2.1.6 陈皮鉴别 取QSDH 约5 g，加20 mL 量的甲醇，超声处理30 min，取10 mL 量的上清液，浓成1 mL 供试品溶液。另取陈皮对照药材2 g，用上面方法配对照药材溶液。再取用甲醇饱和过的橙皮苷对照品作对照品溶液。按照薄层色谱法试验[1]，在同一块高效G 上点3 种溶液，每种1 μL，用丁酮-乙酸乙酯-甲酸-水（6:10:2:1）溶液展开，取出，晾干，用三氯化铝试液，被测颗粒色谱中，紫外光灯（365 nm）下显示和对照药材色谱同位置上一样颜色的荧光斑点，见图 6。

图6 陈皮 TLC 鉴别

2.1.7 葛根鉴别 取QSDH 约1 g，加入10 mL 甲醇，浸2 h，得到滤液，蒸干后滴0.5 mL 甲醇溶成供试品溶液。另取葛根对照药材0.8 g，和上面方法配对照药材溶液。再取葛根素对照品，加甲醇制成1 mL/mg 的溶液，作对照品溶液。按照薄层色谱法试验[1]，在同一块高效G 上点3 种溶液，每种10 μL，用甲醇-三氯甲烷-水（2.5:7:0.25）溶液展开，拿出，挥干，被测颗粒色谱中，紫外光灯（365 nm）下显示和对照药材色谱同位置上一样颜色的荧光斑点，见图7。

图7 葛根 TLC 鉴别

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：岛津VP-ODS（4.6×150 mm，5 m）；流动相：乙腈-水（32:68 ）；流 速 ：1.0 mL/min；柱温：30 ℃。检测器：ELSD，漂移管温度 ：100 ℃，空气流速：2.8 L/min。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。

2.2.2 对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量，精准称量，混合甲醇配成含0.253 mg/mL 的溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 精准称量QSDH 约5 g，研细，混合50 mL 量的甲醇，称定重量，超声处理30 min，放凉，称定重量，加甲醇补上减少的重量，滤过，蒸干，加20 mL 量的水，微热把残渣溶解，拿水饱和的正丁醇摇匀提取3 次，每次20 mL，混合正丁醇液，用氨试液充分洗3 回，每回20 mL，丢弃氨试液，正丁醇液蒸干后加甲醇溶解，转至2 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 阴性样品溶液的制备 按2.2.3 项下方法制成无黄芪的阴性样品溶液。

2.2.5 专属性考察 按2.2.1 项下方法测定，得对照品、供试品及阴性对照的色谱图，见图8。在这条件下，样品色谱中待测成分峰前后无其他峰干扰，分离效果比较好。

图8 QSDH 高效液相色谱图

2.2.6 方法学考察

2.2.6.1 线性关系的考察 取2.2.2 项下对照品溶液，分别精密吸取4、8、16、32、64 μL，进液相色谱仪，按2.2.1 项下方法测定。水平坐标为黄芪甲苷进样量，垂直坐标为峰面积的Lg 值绘制标准曲线，得黄芪甲苷的回归方程为Y（LgA）=1.841X+5.2126，R=0.9997。结果表明，黄芪甲苷在1.012～16.192 μg 范围内与峰面积的线性关系比较好。

2.2.6.2 精密度试验 精密吸取10 μL 2.2.2 项下对照品溶液，按2.2.1 项下色谱条件，连续测定6 次，结果黄芪甲苷的RSD为0.25%，证明仪器精密度良好。

2.2.6.3 稳定性试验 精密吸取20 μL 2.2.3 项下中同一份供试品溶液，进样时间0、2、4、6、8、24 h 测定，黄芪甲苷峰面积的RSD为0.30%，证明24 h 内供试品溶液基本稳定。

2.2.6.4 重复性试验 取同一批次芪参地黄颗粒适量，按2.2.3项下方法独立制备供试品溶液6份并依法测定，黄芪甲苷含量的RSD为0.59%，证明此方法重复性良好。

2.2.6.5 加样回收率试验 取已知含量芪参地黄颗粒6份（黄芪甲苷含量0.0605 mg/g），精密加入黄芪甲苷对照品溶液（0.14 mg/mL）1 mL，依法测定，计算回收率，黄芪甲苷平均回收率为 98.26%，RSD=0.73%。加样回收率测定结果，见表1。

表1 加样回收率测定结果

3 讨论

黄芪薄层鉴别[2-3]曾用甲醇-三氯甲烷-水（7:13:2）下层溶液展开，但供试品色谱中斑点分离的效果不太好，展开系统极性较低，所以提高了展开系统极性，遂用三氯甲烷-甲醇-水（13:8:2）的下层溶液，且10%硫酸乙醇溶液显色，斑点不清楚，改成用1%香草醛硫酸乙醇溶液在105℃加热让斑点显色清晰；党参薄层鉴别[4-5]曾以药典法中对照品党参炔苷，展开剂正丁醇-冰醋酸-水（7:1:0.5）10%硫酸乙醇溶液显色，但供试品色谱中的荧光斑点与对照品对应性较差，斑点显现不清楚，最后改用三氯甲烷-甲醇-水（13:7:2）的下层溶液；当归薄层鉴别[6-7]曾按药典法乙醚处理对照药材和样品，但供试品中无斑点。试用乙酸乙酯进行萃取，得到的样品与对照药材色谱同位置上，有一样的荧光斑点，阴性样品色谱中无一样斑点；陈皮薄层鉴别[8-9]曾以甲醇-乙酸乙酯-水（17:100:13）为展开剂，展至约3 cm，取出，晾干后用甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20:10:1:1）的上层溶液为展开剂，展开约8 cm（药典法），喷显色剂三氯化铝试液，放紫外光灯（365 nm）下检视，但疑似有阴性干扰，因此改用丁酮-乙酸乙酯-甲酸-水（6:10:2:1）为展开剂，喷显色剂三氯化铝试液，105℃加热1 min 后在紫外光灯（365 nm）下检视；同时枸杞子[10-11]、狗脊[12-14]、葛根[15-17]均经过薄层方法学考察。

黄芪甲苷曾考察了不同的色谱柱、流速、柱温、流动相，不同的提取方法、溶剂种类、溶剂用量和提取时间，最终确定了准确可靠，稳定可行的方法，为后续质量标准的建立提供基础。