冠心病寒凝血瘀证动物模型的建立及评价

李驰坤，靳宏光，成光宇，欧喜燕，丁云录，李晓兵

（长春中医药大学附属医院，长春 130021）

冠心病（coronary heart disease，CHD）近些年来发病概率逐年升高，已成为严重危害人类生命健康安全的疾病。随着人们生活水平逐渐提升，人们饮食结构的变化，生活品质的提高，高盐高脂、缺乏运动的饮食与生活习惯使人们的血糖、血脂等指标严重超标，对心血管的损害越来越大，患病年龄也呈年轻化趋势。中医并无“冠心病”病名，依据患者的临床症状和特征改变，众多医家认为冠心病中的稳定型冠心病归于“胸痹心痛”范围，根据中医理论，属于以气、血、阴、阳虚衰，以至于“君主之官”失于温养为本，以寒凝、气滞、血瘀、痰浊等痹阻心阳、阻滞心脉为标的本虚标实的证候，主要证候要素可以分为气虚血瘀、气滞血瘀、气阴两虚、痰瘀互结等[1-2]。冠心病的主要单一证素包括寒凝证、血瘀证两种[3]，其中，寒凝血瘀证该复合因素，是冠心病心绞痛的证候分布组成中的主要部分[4]。

由于人的特殊性，我们无法直接在人体上进行药物实验。因此，在病证的模拟建型中，实验动物就成为首要选择[5]。杨双杰[6]应用高脂饲料和冠脉结扎结合的方式，喂养和处置自发性高血压大鼠，成功制备出高血压合并高血脂符合心梗的动物模型。王丽云[7]等采用豚鼠构建寒饮伏肺的慢性咳嗽模型，先应用环磷酰胺对豚鼠进行免疫抑制，再应用卵蛋白和氢氧化铝诱发致敏，接着在寒冷条件下进行冷食喂养。经检测豚鼠的咳嗽频繁，气道阻力明显升高，肺组织病理学检测符合寒饮伏肺证表现，确认该模型制备成功。李海洋等[8]发现，发病的GK 大鼠明显存在糖尿病的临床症状，另外糖尿病大血管病变的出现和高脂饮食关系密切，因此，采用了自发形成糖尿病和高脂饮食诱导结合的方法，制备出具有“气阴两虚”特点的大鼠模型。由此可展开大规模的基础研究，探究疾病的产生及发展机制，以及制订有效防治办法，还可对防治措施进行检验，不断重复，不时优化，最终取得最佳治疗方案。由此可见，动物可以代替人们作为实验对象。且在人为的特定条件下进行重复试验[9]。但对于目前动物模型的创建仍与临床上的病证有着一定的差距，因此，本项目严格依据中医对于胸痹心痛证寒凝血瘀证病因病机认识，在以往的研究基础上，采取高脂饮食喂养、垂体后叶素制造缺血和寒冷因素刺激联合的方法进行模型构建，最终建立尽可能合乎临床的寒凝血瘀证的大鼠模型。通过高脂饮食饲养大鼠，是构建动脉粥样硬化模型重要的方法之一[10]。在结合中医典籍的指导下进行造模，这样得出的模型也更加契合中医学中寒凝血瘀证病因病机的特点，更充分地反映该疾病的本质，并能够从模型动物的体征、电生理学、血液生化学和病理学等多层次对模型进行综合评价。

1 材料

1.1 动物 根据不同的模型的建立，选择相适应的动物来建立模型对实验的成功至关重要[11]。选用正常的雄性SD 大鼠SPF 级40 只，体质量（230 g±20）g，大鼠由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，许可证号：SCXK（吉）2018-0007。

1.2 试剂与仪器 垂体后叶素注射液（6 U/2 mL，上海第一生化药业有限公司，批号 160301）、1%戊巴比妥钠（国药集团化学试剂有限公司，批号T20111110），TXB2酶免试剂盒（美国 R&D Systems Inc，批号 20191002B），6-Keto-PGF1α酶免试剂盒（美国 R&D Systems Inc，批号 20191002B）。Powerlab/8sp生理信号收集系统（澳大利亚埃德公司），MC-142L欧姆龙电子体温计（欧姆龙大连有限公司），BIO680酶标仪（美国伯乐公司），Biofuge Stratos 台式高速低温离心机（德国贺利氏公司）。

2 方法

2.1 动物分组 通过随机数字表法将SD 大鼠分为对照组和模型组（寒凝血瘀证组），各20 只。

2.2 造模方法 将模型组大鼠分别独立装入小笼内，置于带有玻璃盖的低温冰柜内，温度为-15℃，持续放置1 h，之后再返回至20℃室温，如此反复6 周时间，于第5 周第5 天给予垂体后叶素20 U/kg 腹腔注射，每日1 次，连续3 d。常规对照组在同样的室温条件下正常喂养。

2.3 观察指标与测定方法 待上述实验完成后，再予2 组大鼠的腹腔内推注1%戊巴比妥钠0.05 mL/kg，等大鼠彻底麻醉了以后，再检测如下指标。

2.3.1 肛温 将电子体温计缓慢地插进到大鼠肛门约2 cm 处，等到数值稳定以后，再读取数据。

2.3.2 心电图 记录模型组造模后30 min 内标Ⅱ导联心电图，以J 点（QRS 波群的终点与ST 段交接处）位移来评价是否有心肌缺血产生，同时以PR 段为基线对J点的位移进行记录，以J 点抬高或降低≥0.1 mV 视为发生心肌缺血[12]，同时记录大鼠心率。

2.3.3 血TXB2、6-Keto-PGF1α测量 利用酶联免疫法测定二者的含量，均按试剂盒指示检测。

2.4 统计学方法 运用SPSS 17.0 软件分析数据，以均数±标准差（）表示，使用t检验进行组间比较，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 2 组大鼠肛温情况比较 见表1。

表1 2 组大鼠肛温情况比较（，n =20） ℃

表1 2 组大鼠肛温情况比较（，n =20） ℃

注：与造模前比较，# P ＜0.05；与对照组比较，△P ＜0.05

3.2 2 组大鼠心电图情况比较 见表2。

表2 2 组大鼠心电图情况比较（，n =20）

表2 2 组大鼠心电图情况比较（，n =20）

注：与对照组比较，# P ＜0.05

3.3 2 组大鼠TXB2、6-Keto-PGF1α情况比较 见表3。

表3 2 组大鼠TXB2、6-Keto-PGF1α 情况比较（，n =20） pg/mL

表3 2 组大鼠TXB2、6-Keto-PGF1α 情况比较（，n =20） pg/mL

注：与对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

4 讨论

冠心病症状为气短、胸闷、胸痛、心慌，其发病大多由寒邪侵袭、饮食失节、情志失调和劳累过度引起[13]。冠心病是现代社会多发疾病，其致残率和致死率逐年升高，已造成了沉重的社会经济负担[14]。近年来，在治疗冠心病方面，中医药充分发挥特长，以辨证论治为根本，从多路径、多环节、多靶点进行系统治疗，获得了较好的临床疗效。因此，对其进行更深层次的探索尤为必要，不仅从临床方面，还要进行基础研究，从而获得最优方案，提高疗效，缩短病程，减少社会经济支出。动物模型的建立是冠心病基础研究中的重要环节，如何规范化的建立既具备西医疾病特点，又合乎中医证候特征的模型，对于中医药的基础研发具有重要意义。

中医动物模型的证型建立需要借鉴现代科技方法，并与之结合，不能局限于单一的生理变化，要整体对实验动物进行评估，从多角度，多方面进行观察，才有利于中医病证动物模型的成功建立。从整体、系统出发，有利于更加深入地理解中医的传统理论，从而逐渐深入探索出“证”的本质[15-16]。

实验动物模型的创建，原则上应选取与人类构造最为接近的动物[17]，如小猪是最佳选择，因为小猪的心血管结构和人类的最为相近，但由于实验小猪价格相对较高，不易于实际应用与实验，而大鼠虽不如小猪和人类心血管结构相近，但容易饲养，方便管理，检验测量相关指标也相对容易，故将大鼠作为本实验的模型动物。

在该实验动物模型的建立过程中，参考了胸痹心痛病寒凝血瘀证的诊断标准：胸痛如绞，时作时止，感寒痛甚，胸闷，气短，心悸，面色苍白，四肢不温，舌质淡红，苔白，脉沉细或沉紧。但由于大鼠与人类有着差异，所以对于大鼠的证候确认通过以下方式：查超声心动图来反应大鼠的是否有胸闷痛；观测大鼠的呼吸来体现是否心悸气短；用空调来调节温度来观察大鼠的胸闷痛是否与寒冷相关；因大鼠和人的差异，面色没法收集，所以通过观测大鼠足底图像来代表面色；利用温度计以测定四肢温度；用舌面的颜色饱和程度来体现舌象变化；测量血管搏动强度来体现脉象情况。最后再结合大鼠的病理指标，建成完整的寒凝血瘀证型模型。冠脉造影[18]（CAG）是诊断冠心病的金标准，但是由于冠脉造影价格较高，所以也不作为动物模型建立的诊断标准。

J 点，位于QRS 波后，T 波之前，二者交界的地方，即ST段起始部，ST段的位移可反映心肌缺血的情况。寒性凝滞，使血脉收缩，气血运行不畅，日久导致瘀血，因此出现J 点的位移，即ST 段的变化；寒性凛冽，易伤阳气，心为人体之太阳，故首当其冲，心阳不足，失于温煦，因此鼓动乏力，不仅心率减慢，更使气血运行迟滞。

垂体后叶素[19]是一种从动物的脑垂体中提取的物质，大量的垂体后叶素静脉注射可引起冠状动脉较长时间的强烈痉挛，同时还收缩全身小血管，加重外周负荷，增加心肌的耗氧量，导致急性心肌缺血，引起急性心绞痛发生。TXA2与PGI2的稳定代谢产物是TXB2、6-Keto-PGF1α，故检测TXA2和PGI2在体内的含量与活性，只需测量TXB2和6-Keto-PGF1α含量水平即可[20]。TXA2与PGI2均由血管内皮细胞合成并释放，是一种血管活性物质，TXA2能促进血管收缩和血小板聚集，PGI2则与之作用相反，在舒张血管的同时抑制血小板的聚集[21]，TXA2/PGI2的失衡被认为是血瘀证的特征之一[22]。

中医认为，寒性收引，易伤阳气，使血脉运行不畅通，进而出现瘀滞。《素问·调经论篇》曰：“寒气积于胸中而不泻，不泻则温气去，寒独留，则血凝泣，凝则脉不通。”即阐明寒邪侵犯于人体胸部而不消散，寒邪留存，使血脉凝涩。本研究通过股静脉注射较大剂量的垂体后叶素，使其冠脉收缩，再结合反复冷刺激法，构建出寒凝血瘀证动物模型，通过测量肛温降低、心率减慢等指标，反映出寒冷因素对大鼠体温的影响；心电图J点变化，符合急性心肌缺血心电图的特点[23]，TXB2水平的显著上升以及6-Keto-PGF1α的下降与血瘀证特点吻合。

综上所述，应用本方式可成功建立大鼠寒凝血瘀证模型，既具备西医疾病的病理特点，又合乎中医的证候特性，且客观性强。