八珍益智方中非挥发性成分在大鼠体内的代谢产物

卜凡淑，牛 阳，张 婷，黄楷迪，钱大玮，段金廒

（1.南京中医药大学，江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏省方剂高技术研究重点实验室，江苏 南京210023； 2.宁夏医科大学回医药现代化教育部重点实验室，宁夏 银川750004； 3.中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏 南京 210023）

随着生活压力的加大、老年人口的增多，记忆力减退已成为影响人们生活质量的重要因素。八珍益智方来源于《成方便读》，具有增强智力、延缓衰老、提高记忆力的功效［1］，由龙眼肉、益智仁、陈皮、炙甘草、茯苓、白术、莲子肉、山药组成。近年来，八珍益智方在制备工艺、药理活性方面的研究取得了一定进展［2⁃3］，但尚无其整方给药在大鼠体内的代谢产物分析及过程考察。

药物进入体内后，通常会产生一种或多种代谢产物，对其研究有助于阐明体内药效物质基础［4］。高效液相色谱⁃串联质谱（LC⁃MS／MS）法因其高灵敏度、高选择性，被广泛应用于中药代谢产物的考察中，通过结合基于质量亏损滤过为基础的代谢物寻找软件来寻找目标代谢物，再进一步对目标代谢物进行MS／MS 分析，可快速推测复杂生物基质中的代谢产物［5］。本实验采用超高效液相色谱⁃线性离子阱⁃静电轨道阱串联质谱联用（UHPLC⁃LTQ⁃Orbitrap⁃MS）法，分析大鼠灌胃给予八珍益智方后血浆、胆汁、尿液、粪便中的非挥发性成分及代谢产物，以期为该方药效物质基础研究提供依据。

1 材料

UltiMate 3000 型超高效液相色谱仪、LTQ⁃Orbitrap Velos Pro 质谱仪、Xcalibur 3.0 质谱工作站软件、Metworks 1.3 及Mass Frontier 7.0 分析软件（美国Thermo 公司）；Anke GL⁃16G II 型离心机（上海安亭科学仪器厂）；WH⁃微型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；ML204、MS105电子天平［梅特勒⁃托利多仪器（上海）有限公司］。

异甘草苷（R07D8F50056）、异甘草素（C03A8Q41092）、桔皮素（H09M7K14409）、橙皮素（C03F6Y1）、茯苓新酸A（150417）、白杨素（X24O6C4947）对照品均购于上海源叶生物科技有限公司，纯度均≥98%。龙眼肉、茯苓、益智仁、陈皮、炙甘草、山药、白术、莲子肉由安徽省亳州市紫锐药业有限公司提供，经南京中医药大学严辉副教授鉴定为正品，符合2020 年版《中国药典》 要求，具体见表1。甲酸、甲醇、乙腈为色谱纯（德国Merck 公司）；超纯水由Milli⁃Q 纯水机制备。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

清洁级雄性SD 大鼠，约8 周龄，体质量（220±10）g，由北京市维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产合格证号SCXK（京）2016⁃0006。饲养温度20～25 ℃，相对湿度（45±10）%。

2 方法

2.1 检测条件 ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相乙腈（A）⁃水（含0.1%甲酸）（B），梯度洗脱（0～7 min，0～5%A；7～12 min，5%～15% A；12～16 min，15%～35% A；16～22 min，35%～45% A；22～25 min，45%～70% A；25～27 min，70%～90% A；27～28 min，90%～100%A；28～30 min，100%A）；体积流量0.4 mL／min；柱温30 ℃；进样量2 μL。电喷雾离子源（ESI），正负离子扫描模式，扫描范围m／z50～1 000；采集时间0.8～30 min；毛细管温度350 ℃；蒸发器温度350 ℃；鞘气流40 kPa；辅助气流15 kPa；喷雾电压3.5 V；源电流100 μA；MS2质谱的触发方式为动态数据依赖分析模式。

2.2 供试品溶液制备 各单味药材饮片分别按八珍益智方日用处方量称取，混合均匀后加水回流提取2 次，第1 次按料液比1 ∶12 用水蒸气蒸馏法提取6 h，收集挥发油，过滤提取液，第2 次按料液比1 ∶10 同法提取2 h，过滤提取液，合并滤液，减压浓缩后制成生药量为1.40 g／mL，即得。

2.3 对照品溶液制备 精密称取异甘草苷、异甘草素、桔皮素、橙皮素、白杨素、茯苓新酸A 对照品适量，甲醇制成1 mg／mL 溶液，即得。

2.4 分组与给药 24 只大鼠随机分为空白组和给药组，每组12 只（血浆组、胆汁组、尿液／粪便组各4 只），给药组大鼠灌胃给予八珍益智方水煎液，剂量为13.95 g／kg，加入挥发油混合均匀，连续3 d，每天1 次；空白组大鼠灌胃给予等体积生理盐水。

2.5 生物样品采集 大鼠最后1 次给药前禁食不禁水12 h，其中血浆组大鼠于给药后0.5、1、2、4、6、8 h 眼眶静脉丛取血各0.5 mL，置于预先涂有1%肝素钠生理盐水的EP 管中，4 000 r／min 离心10 min，取上清，即得血浆样品；胆汁组大鼠用10%水合氯醛麻醉，插入胆管并固定，给药后收集10 h 内胆汁；尿液／粪便组大鼠收集36 h 内尿液／粪便，每12 h 1 次。样品均置于－80 ℃下保存。

2.6 生物样品处理

2.6.1 血浆 将大鼠各时间点血浆样品等体积合并，以消除个体差异性。取300 μL 血浆样品，加入3 倍量甲醇沉淀蛋白，涡旋30 s，12 000 r／min离心10 min，取上清液离心浓缩，加入0.1%甲酸、甲醇各50 μL 复溶，12 000 r／min 离心10 min，取上清液。

2.6.2 胆汁 取大鼠各时间点混合胆汁样品200 μL，加入200 μL 甲醇涡旋30 s，12 000 r／min离心10 min，取上清液。

2.6.3 尿液 取大鼠各时间点混合尿液样品500 μL，加入500 μL 甲醇涡旋30 s，12 000 r／min离心10 min，取上清液，离心浓缩，加入200 μL 0.1%甲酸复溶，12 000 r／min 离心10 min，取上清液。

2.6.4 粪便 将大鼠不同时间点粪便按质量比混合，取0.5 g，加1.5 mL 50%甲醇超声处理30 min，上清液涡旋30 s，12 000 r／min 离心10 min，取上清液。

3 结果

3.1 UHPLC⁃LTQ⁃Orbitrap⁃MS 分析通过MetWorks代谢物鉴定软件中的质量亏损过滤功能，除去基质中的信号干扰，结合对照品及参考文献中的保留时间，一级、二级质谱信息，共得到46 种成分，其中原型6 种，代谢产物40 种。提取离子流图见图1～2。

图1 正离子模式下提取离子流图Fig.1 Extracted ion current chromatograms in positive ion mode

以八珍益智方水提液前期分析为基础，确定其主要成分为黄酮、三萜酸、三萜皂苷。药物的氧化代谢产物及部分结合代谢产物质量亏损值近似于母药，但某些代谢反应的质量亏损会具有明显变化，如母药分子产生裂解反应、谷胱甘肽结合反应、脱烷基代谢产物等。本实验依据这一规律，根据取代基的种类和数量设定参数，见表2。

图2 负离子模式下提取离子流图Fig.2 Extracted ion current chromatograms in negative ion mode

表2 质量亏损参数Tab.2 Parameters for mass defects

将质量亏损设置为较宽范围进行初步筛选，虽然基质干扰离子在一定程度上会相应增加，但也可发现更多目标及非目标化合物，再结合ppm 小于1.0×10－5的条件寻找符合代谢修饰的代谢产物准分子离子峰，依据文献报道、二级质谱碎片离子分析代谢物结构特征，通过Mass Frontier 7.0 谱图解析软件作进一步验证，即可得到各类化合物相应代谢物。以粪便样品正离子检测模式为例，其总离子流图和经质量亏损过滤后的总离子流图见图3，可知经质量亏损过滤后的TIC 基线更平稳，色谱峰也有所增强。

图3 粪便样品在正离子模式下（A）、经质量亏损过滤后总离子流图（B）Fig.3 Total ion current chromatograms of stool sample in positive ion mode（A）and after mass defect filtering（B）

3.2 代谢产物分析

3.2.1 异甘草苷（A）、异甘草素（B）共鉴定出4 个异甘草苷代谢产物、10 个异甘草素代谢产物，具体见表3、图4。其中，异甘草苷的主要碎片离子m／z255，为异甘草苷脱去一分子葡萄糖产生的碎片离子，也是异甘草素的特征分子离子峰；异甘草素属查尔酮类衍生物，2 个苯环之间有3 个碳原子相连，其中2 个碳原子由α、β⁃不饱和碳构成，易发生RDA 裂解产生m／z135、119、91 的特征碎片离子。A0 是异甘草苷，保留时间为16.80 min，负离子模式下准分子离子峰为m／z417.115 5 ［M⁃H］－，具有m／z255 的特征碎片离子，进一步脱一分子C8H8O 产生m／z135.066 3 的碎片，与对照品相符；代谢物A1、A2、A3 的准分子离子峰分别为m／z433.110 9、449.105 8、497.072 4，比异甘草苷大16、32、80，而且都具有255 的特征碎片离子，推测为异甘草苷单氧化、双氧化和硫酸化产物；A4 比A1 大80，推测为异甘草苷氧化硫酸化产物。

图4 异甘草苷（A）、异甘草素（B）代谢途径Fig.4 Metabolic pathways of isoliquiritin（A）and isoliquiritigenin（B）

表3 异甘草苷、异甘草素代谢产物Tab.3 Metabolites of isoliquiritin and isoliquiritigenin

在体内代谢过程中，异甘草苷结构中的糖苷键易于水解丢失葡萄糖而形成苷元，代谢物B0 分子量较异甘草苷少162，保留时间为20.04 min，准分子离子峰为m／z255.066 9 ［M⁃H］－，在MS／MS图谱上观察到m／z135、119、91 的碎片离子，与对照品相符，鉴定为异甘草素；代谢物B1、B2 分子量分别比异甘草素大57、119，推测其为异甘草素甘氨酸和半胱氨酸结合产物；B3、B6、B8 分子量分别比 异甘草素大16、32、48，具 有m／z135.066 3 的特征碎片，推测为异甘草素单氧化、双氧化、三氧化产物；B4、B7 分子量分别比B3、B6 大80，可能为后者硫酸化产物；B5 分子量比B3 大176，具有m／z255、135 的特征碎片，推测为异甘草素的氧化醛酸化产物；B9、B10 分子量比异甘草素大176、256，可能为醛酸化、醛酸化加硫酸化产物；B11 分子量比异甘草素大2，具有m／z135、91 的特征碎片，推测为异甘草素的还原产物。Ⅱ相反应（如葡萄糖醛酸化、硫酸化）为异甘草素主要代谢途径，与文献［6⁃8］ 报道一致。

3.2.2 白杨素（C）共鉴定出4 个白杨素代谢产物，具体见表4、图5。其中，C0 保留时间为22.34 min，正离子模式下准分子离子峰为m／z255.063 5 ［M＋H］＋，具有m／z153.018 2 的特征碎片离子，与对照品相符，鉴定为白杨素；C1 准分子离子峰为m／z335.004 7 ［M＋H］＋，比白杨素大80，而且有m／z255 的碎片离子，推测为白杨素的硫酸化产物；C2 分子量比白杨素大176，推测为白杨素的葡萄糖醛酸化产物［9］；C3 分子量比白杨素大16，具有m／z255、153 的碎片，可能为白杨素的羟基化产物；C4 分子量比白杨素大14，可能为甲基化产物，虽然白杨素的7′⁃OH 甲基化为杨芽黄素，但C4 与其对照品保留时间不一致，故甲基化反应发生在5′⁃OH。

3.2.3 茯苓新酸A（D）共鉴定出4 个茯苓新酸A 代谢产物，具体见表4、图5。其中，D0 是茯苓新酸A，保留时间为27.15 min，正离子模式下准分子离子峰为m／z499.341 4 ［M ＋H］＋，m／z463.320 7为脱两分子H2O 产生的碎片，与对照品相符；D1 为D0 的脱甲基产物，m／z411.315 6 为其脱一分子C3H6O2产生的碎片；D2 分子量比D1大80，可能D1 的硫酸化产物；D3 分子量比D0 小2，m／z479.315 6 为脱水产生的碎片，推测为茯苓新酸A 的脱氢产物；D4 分子量比D1 大2，m／z413.315 6为脱C3H6O2的碎片，推测为茯苓新酸A 脱甲基后的还原产物。上述代谢途径与文献［10］ 报道一致。

3.2.4 橙皮素（E）共鉴定出5 个橙皮素代谢产物，具体见表4、图5。其中，E0 是橙皮素，保留时间为19.15 min，正离子模式下准分子离子峰为m／z303.087 7 ［M＋H］＋，m／z285.075 7 为脱一分子H2O 碎片，m／z177.054 6 为橙皮素脱一分子C6H6O3产生的特征离子碎片，与对照品相符；E1、E2 分子量分别比橙皮素大80、176，均含有m／z303、153 的碎片，推测分别为橙皮素的硫酸化、醛酸化结合产物；E3 分子量比橙皮素大14，推测为橙皮素的甲基化产物；E4 分子量比橙皮素小14，具有m／z135 的离子碎片，可能为橙皮素的脱甲基产物；E5 比橙皮素小30，具有m／z153 的碎片，可能为橙皮素的脱甲氧基产物［11⁃12］。

图5 白杨素（C）、茯苓新酸A（D）、橙皮素（E）代谢途径Fig.5 Metabolic pathways of chrysin（C），poricoic acid A（D）and hesperetin（E）

表4 白杨素、茯苓新酸A、橙皮素代谢产物Tab.4 Metabolites of chrysin，poricoic acid A and hesperetin

3.2.5 桔皮素（F）共鉴定出12 个桔皮素代谢产物，具体见表5、图6。其中，F0 是桔皮素，保留时间为24.06 min，正离子模式下准分子离子峰为m／z373.125 5 ［M＋H］＋，m／z358.104 7 为脱一分子CH3碎片，m／z343.117 6 为进一步脱CH3碎片，与对照品相符；F1⁃1、F1⁃2、F1⁃3 分子量比桔皮素小14，保留时间不一致，但都具有m／z344 脱甲基碎片，推测为桔皮素不同位点的脱甲基反应；F2、F3、F4 分子量分别比F1 大16、80、176，可能为桔皮素脱甲基使酚羟基暴露从而进一步发生羟基化、硫酸化、醛酸化结合反应；F5、F6 分子量分别比F2 大80、176，可能为桔皮素脱甲基后发生羟基硫酸化和羟基醛酸化的多步代谢反应；F7分子量比桔皮素小28，均具有脱一分子CH3的m／z330.073 4 碎片离子，推测为桔皮素不同位点的双脱甲基反应；F8 分子量比F7 大16，可能为桔皮素双脱甲基后的羟基化代谢物；F9 分子量比桔皮素小36，可能为桔皮素的三脱甲基产物。上述代谢途径与文献［13］ 报道一致。

图6 桔皮素（F）代谢途径Fig.6 Metabolic pathway of tangeretin（F）

表5 桔皮素代谢产物Tab.5 Metabolites of tangeretin

4 讨论与结论

异甘草苷在大鼠体内主要生成脱葡萄糖基的苷元异甘草素，进而发生一系列II 相结合反应。代谢物在胆汁中较少，大多见于尿液、粪便中，说明胆汁排泄不是异甘草素在大鼠体内的主要排泄途径［14］；在尿液、粪便中可检测到白杨素原型存在，但共同成分——杨芽黄素可去甲基形成白杨素，故并不能排除部分白杨素是由该成分脱甲基转化而来。本实验中水提液提取时间为6 h，在长时间高温煎煮下，小极性化合物被少量提取出来，在粪便中检测出3 种代谢产物［10］。前期发现，八珍益智方水提取物中橙皮苷含量很高，但大鼠体内并未发现其原型物；文献［15］ 报道，橙皮苷在体内可转化为橙皮素后被吸收，但本实验仅在血浆、尿液中检测到橙皮素原型和代谢物。桔皮素虽无游离的酚羟基结构，但在体内容易通过Ⅰ相代谢酶的催化，将甲氧基转化为羟基进而发生Ⅱ相代谢反应。多甲氧基黄酮类化合物的代谢物比原型具有更好的抗炎活性［16］，故桔皮素在体内的主要代谢通路为去甲基，其主要代谢物大多分布在胆汁、尿液中。

八珍益智方中龙眼肉、山药主要成分为多糖、蛋白质、氨基酸，莲子肉主要成分为蛋白质、淀粉，白术主要成分为多糖、挥发油、内酯，但无法确定蛋白质、多糖代谢产物；内酯在药材中含量较低，或吸收进入体内后经代谢、分布、排泄等而在血、尿中含量很低，导致超出仪器检测限而无法测得，具体仍需进一步研究。

综上所述，本实验 首次利 用UHPLC⁃LTQ⁃Orbitrap⁃MS 法对大鼠灌胃给予八珍益智方后非挥发性成分的体内代谢产物进行研究，可为进一步探讨该方体内过程、阐明其功效物质基础提供依据。