一测多评法同时测定舒血宁注射液中4 种银杏内酯

游蓉丽，林 珊，杨晓宁，高治华，姚 静

（1.中国中医科学院中医临床基础医学研究所，北京100700； 2.上海医药工业研究院，上海200433；3.北京振东光明药物研究院有限公司，北京100085； 4.山西振东泰盛制药股份有限公司，山西 大同 037010）

舒血宁注射液是由银杏叶提取物制成的中药注射剂，临床上主要用于治疗缺血性心脑血管疾病、冠心病、心绞痛等，具有较好的疗效［1⁃3］，其主要活性成分为银杏内酯、黄酮［4⁃6］，前期大多采用HPLC⁃ELSD 法测定银杏内酯A、B、C 和白果内酯含量［7］，但流动相采用非常规、复杂的正丙醇⁃甲醇⁃四氢呋喃⁃水系统，而且样品前处理时需进行乙酸乙酯萃取、复溶等操作［8］，增加了准确定量难度和分析工作量。本实验采用常规的甲醇⁃水流动相系统，并在简化样品前处理方法的基础上，以更易得、廉价的银杏内酯A 为内标，计算它与银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯的相对校正因子，建立一测多评法同时测定舒血宁注射剂中上述4 种成分的含量［9⁃10］，以期为该制剂质量评价提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱系统（配置四元梯度泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱、VWD 检测器）、Agilent 385⁃ELSD 蒸发光散射检测器（美国Agilent Technologies公司）；MSA365⁃OCE⁃OH 电子分析天平（德国Sartorios 公司）；Milli⁃Q Advantange A10 纯水机（美 国Millipore 公司）；KQ⁃250DE 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 银杏内酯A（纯度97.4%，批号110862⁃201602）、银杏内酯B（纯度95.6%，批号110863⁃201611）、白果内酯（纯度99.8%，批号110865⁃201507）、银杏内酯C（纯度94.0%，批号110864⁃201809）对照品均购于中国食品药品检定 研究院。舒血宁 注射液（批 号 1905262、1905271、1905272、1905281、1905282、1906181、1906182、1906191、1906192）由振东泰盛药业有限公司提供。乙腈、甲醇为色谱纯［阿达玛斯试剂（上海）有限公司］。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C 对照品适量，甲醇制成每1 mL 分别含四者0.09、0.25、0.13、0.19 mg的溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液 取舒血宁注射液适量，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件TSK gel ODS⁃100V 色谱柱（150 mm×4.6 mm，3 μm）；流动相水（A）⁃甲醇（B），梯度洗脱（0～10 min，90%～75%A，10%～25%B；10～50 min，75%～65% A，25%～35% B；50～55 min，65%～40%A，35%～60%B）；体积流量0.6 mL／min；柱温30 ℃；进样量20 μL；ELSD检测器漂移管温度90 ℃；氮气（N2）体积流量1.5 L／min。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 文献［4⁃5］ 报道，舒血宁注射液主要成分为银杏内酯、黄酮醇苷。图1 显示，样品中该成分色谱峰分离较好，相同条件下空白溶剂无干扰峰，表明该方法专属性良好。

图1 各银杏内酯HPLC⁃ELSD 色谱图Fig.1 HPLC⁃ELSD chromatograms of various ginkgolides

2.3.2 线性关系考察 制备6 个质量浓度对照品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定。以各成分进样量的常用对数为横坐标（X），峰面积的常用对数为纵坐标（Y）进行回归，并分别以信噪比（S／N）10 ∶1、3 ∶1 为定量限、检测限，结果见表1，可知各银杏内酯在各自范围内线性关系良好。

表1 各银杏内酯线性关系Tab.1 Linear relationships of various ginkgolides

2.3.3 精密度试验 精密吸取对照品溶液20 μL，在“2.2”项色谱条件下进样测定6 次，计算日内精密度；另精密吸取对照品溶液10 μL，在“2.2”项色谱条件下连续进样测定3 d，每天2 次，计算日间精密度，测得白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C 峰面积RSD 分别为2.82%、2.16%、2.04%、3.26%，表明该方法精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取注射液（批号1905262）6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样20 μL 测定，测得白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C 含量RSD 分别为1.99%，2.15%，1.85%，2.96%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取注射液（批号1905262）1份，于0、3、6、9、12、24 h 在“2.2”项色谱条件下进样20 μL 测定，测得白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C 峰面积RSD 分别为3.09%、3.19%、2.30%、3.82%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验 精密量取5.0 mL 注射液（批号1905262）至10 mL 量瓶中，平行9 份，其中3 份加入对照品溶液0.5 mL，甲醇定容，作为低质量浓度组供试品溶液；3 份加入对照品溶液1.0 mL，甲醇定容，作为中质量浓度组供试品溶液；3 份加入对照品溶液1.5 mL，甲醇定容，作为高质量浓度组供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下各进样20 μL 测定，计算回收率，结果见表2。

2.4 相对校正因子测定 精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液4、8、10、15、20、25 μL，在“2.2”项色谱条件下进样测定，以银杏内酯A 为内标，计算其他3 种成分的相对校正因子fs／k，公式为fs／k＝（Ms×lgAk）／（Mk×lgAs），其中Ms为内标质量，Mk为其他成分质量，lgAs为内标峰面积对数，lgAk为其他成分峰面积对数，结果见表3。

表3 各成分相对校正因子Tab.3 Relative correction factors of various constituents

2.5 色谱峰定位 分别在不同柱温、体积流量、色谱仪下测定相对保留时间，结果见表4～6，可知RSD 或相对误差均＜2%，表明以相对保留时间定位色谱峰合理可行。

表4 不同柱温下相对保留时间Tab.4 Relative retention time under different column temperatures

表5 不同体积流量下相对保留时间Tab.5 Relative retention time under different volumetric flow rates

表6 不同色谱仪下相对保留时间Tab.6 Relative retention time under different chromatographic instruments

2.6 耐用性考察 取同一份注射液，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，并分别在不同柱温、体积流量、色谱仪下对相对校正因子进行考察，结果见表7～9，可知RSD或相对误差均＜2.0%，表明该方法重复性良好。

表7 不同柱温下相对校正因子Tab.7 Relative correction factors under different column temperatures

表8 不同体积流量下相对校正因子Tab.8 Relative correction factor under different volumetric flow rates

表9 不同色谱仪下相对校正因子Tab.9 Relative correction factors under different chromatographic instruments

2.7 样品含量测定 取9 批舒血宁注射液，分别采用外标法、一测多评法测定4 种银杏内酯含量，再通过SPSS 14.0 软件对结果进行t检验，结果见表10，可知均无显著差异［相对平均偏差（RAD）＜2%］，表明一测多评法稳定可行。

表10 各银杏内酯含量测定结果（n＝9）Tab.10 Results of content determination of various ginkgolides（n＝9）

3 讨论

3.1 流动相确定 2020 年版《中国药典》 一部含量测定项［11］及文献［12⁃13］ 报道中检测银杏内酯时，均采用四氢呋喃，但其毒性较大。本实验比较了甲醇⁃水、甲醇⁃乙腈⁃水体系下目标化合物的分离效果，发现前者洗脱时4 种成分色谱峰的峰形、分离度良好，基线平稳，而且更简便环保。

3.2 样品处理方法确定 为了更准确地反映舒血宁注射液中萜类、内酯类成分的真实含量，本实验采用注射液直接进样的方法进行检测，发现4 种成分的分离效果良好，杂质无干扰。相对于文献［8，12⁃14］ 采用乙酸乙酯萃取、蒸干、复溶等前处理方法，本实验可大大减轻分析人员的工作量，并提高含量测定的准确性。

3.3 一测多评法考察 银杏内酯A 是舒血宁注射液主要特征成分之一，含量较高，而且其对照品容易获得，质量稳定，价格低廉，故本实验选择其作为内标［14］。再考察了在不同色谱仪、柱温、体积流量下白果内酯、银杏内酯B、银杏内酯C 的相对保留时间及相对校正因子，发现其重复性均较好。最后，将一测多评法所得结果与外标法进行比较，发现无明显差异，表明该方法可用于舒血宁注射液中4 种银杏内酯含量的测定。