霍山石斛花总黄酮微波辅助提取工艺的优化

吴进东，董欣华，朱旺生，张国星

（皖西学院，安徽 六安 237012）

霍山石斛属兰科石斛属植物，产于大别山区安徽霍山及其邻近地区，是我国名贵中药［1］。石斛属植物花中含有丰富的黄酮［2］，具有抗氧化、抗菌、抗炎、降血压、清热解毒等作用［3⁃5］，其提取方法主要包括水提［6］、碱提［7］、有机溶剂提取［8］、超声波提取［9⁃10］、超临界流体提取［11］、酶辅助提取［12］等，但都具有一定局限性，而微波辅助提取是一种快速高效、安全环保的提取方法［13⁃18］。本实验针对现有霍山石斛花总黄酮提取工艺存在的不足，采用微波辅助提取，并对其进行优化，以期为该药材开发利用提供依据。

1 材料

UV⁃1800 紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；UWave⁃2000 多功能微波合成萃取仪（上海新仪微波化学科技有限公司）；TDL⁃4 台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；中药粉碎机（瑞安市百信药机器械厂）。霍山石斛花由皖西学院植物园植物细胞功能中心提供，经皖西学院陈存武教授鉴定为正品。芦丁对照品（南京杜莱生物科技有限公司）。乙醇、NaOH、亚硝酸钠、硝酸铝等为分析纯。

2 方法

2.1 原料预处理 参考葸玉琴等［8］报道的方法，霍山石斛花除杂后用蒸馏水洗净，吸水纸吸干，置于105 ℃烘箱中杀青20 min，80 ℃下烘干至恒重，粉碎成粉末，过40 目筛，贮藏于干燥箱中备用。

2.2 总黄酮提取 参考葸玉琴等［8］报道的方法，准确称取1.0 g 粉碎的样品，置于50 mL 三角瓶中，加入一定体积分数乙醇进行微波辅助提取，静置冷却后抽滤，加入相应体积分数的乙醇洗涤滤饼，合并滤液，离心，取上清液，紫外分光光度仪测定其吸光度。

2.3 线性关系考察 参考易建华等［12］报道的方法，精确称取120 ℃下干燥至恒重的芦丁对照品20 mg 左右，置于100 mL 量瓶中，60%乙醇溶解稀释至刻度，精确量取25 mL，置于50 mL 量瓶中，蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得0.10 mg／mL 标准溶液。吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于6 支10 mL 具塞试管中，加30% 乙醇至5 mL，精确加入5% NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min后加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min 后加入1 mol／L NaOH 溶液4 mL，加水0.4 mL，摇匀，放置15 min，以第一管为空白，于510 nm 波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标（A），总黄酮质量浓度为横坐标（X）进行回归，得方程为A＝9.176 9X－0.119 0（R2＝0.999 8）。

2.4 总黄酮提取量测定 取适量待测液于比色管中，按“2.3”项下回归方程测定总黄酮质量浓度，计算提取量［10］，公式为提取量＝C×V×n／m，其中C表示待测液中总黄酮质量浓度，V表示提取液总体积，n表示稀释倍数，m表示样品质量。

3 结果

3.1 单因素试验 本实验选择乙醇体积分数、微波时间、微波温度、液料比作为影响因素，水平分别为30%、45%、60%、75%、90%，1、2、3、4、5 min，50、60、70、80、90 ℃，20 ∶1、35 ∶1、50 ∶1、65 ∶1、80 ∶1，考察它们对总黄酮提取量的影响，结果见图1～4。由此可知，各因素对总黄酮提取量都有明显影响，而且均呈先升后降的趋势，其中乙醇体积分数适宜水平在75% 左右，微波时间在2～4 min 之间，微波温度在60～80 ℃之间，液料比在35 ∶1～80 ∶1 之间。

图1 乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

图2 微波时间对总黄酮提取量的影响Fig.2 Effect of microwave time on extraction yield of total flavonoids

图3 微波温度对总黄酮提取量的影响Fig.3 Effect of microwave temperature on extraction yield of total flavonoids

图4 液料比对总黄酮提取量的影响Fig.4 Effect of liquid⁃solid ratio on extraction yield of total flavonoids

3.2 响应面法 在“3.1”项下结果基础上，采用响应面法作进一步优化，设定乙醇体积分数（A）水平分别为50%、65%、80%，微波时间（B）水平分别为2、3、4 min，微波温度（C）水平分别为55、70、85 ℃，液料比（D）水平分别为40 ∶1、55 ∶1、70 ∶1，总黄酮提取量（Y）作为评价指标，结果见表1。

对表1数据进 行拟合，得到方程为Y＝－96.436 167＋1.707 156A＋8.960 333B＋0.619 467C＋0.559 756D－ 0.022 000AB－ 0.016 222AC＋0.000 044AD＋ 0.010 667BC－ 0.006 333BD－0.002 766CD－ 0.011 487A2－ 1.299 500B2－0.002 642C2－0.003 020D2，方差分析见表2。由此可知，模型影响显著（P＜0.01），失拟度不显著（P＞0.05），表明其拟合度高；决定系数R2＝0.955 3，＝0.910 6，变异系数CV ＝4.28%＜5%，表明该模型重复性好；各因素影响程度依次为乙醇体积分数＞微波温度＞料液比＞微波时间，其中乙醇体积分数极显著（P＜0.01），微波温度、液料比显著（P＜0.05），微波时间不显著（P＞0.05）。

表1 试验设计与结果Tab.1 Design and results of tests

表2 方差分析Tab.2 Analysis of variance

通过Design expert 8.0.6 软件进行响应面分析，结果见图5。由此可知，随着乙醇体积分数、微波时间、微波温度、液料比增加，总黄酮提取量均呈先升后降的趋势，以乙醇体积分数、微波温度、液料比更明显（P＜0.05），与单因素试验结果吻合；微波温度与液料比的响应面最陡峭，说明两者有显著互作效应，与方差分析结果一致。最终确定，最优工艺为乙醇体积分数66.30%，液料比56.37 ∶1，微波温度73.64 ℃，微波时间3.05 min，总黄酮提取量12.41 mg／g，考虑到操作方便，将其修正为乙醇体积分数66%，液料比56 ∶1，微波温度74 ℃，微波时间3 min。按上述优化工艺进行6 批验证试验，测得总黄酮平均提取量为12.23 mg／g，与预测值12.41 mg／g 接近（相对误差为1.45%），表明该工艺稳定可行。

图5 各因素响应面图Fig.5 Response surface plots for various factors

4 讨论

近年来，微波辅助技术因其具有加热均匀、省时高效、节能环保、操作简单的特点，在提取植物黄酮类物质中被广泛应用。微波辐射能改变提取液中极性分子的取向，活化黄酮分子，使其更易于提取［19］，当乙醇与提取物质极性越接近时，提取物析出量越大，而前者极性与其体积分数呈负相关［20］。单因素试验结果表明，乙醇体积分数在75%左右较适宜，此时溶液极性与总黄酮极性接近，可使提取量最高；微波时间、微波温度分别在2～4 min，60～80 ℃之间较适宜，微波辐射可使细胞内部温度迅速上升，破坏细胞壁及内部结构，细胞内活性成分更容易溶出，从而提高黄酮提取效率［20］；在一定范围内，总黄酮溶出量随着微波时间延长、微波温度增加而升高，但时间过长、温度过高时其结构易被破坏，同时杂质溶出率增加［9］；液料比在30～80 倍之间较适宜，在一定范围内其数值越大，黄酮越容易被充分溶解出来，提取率也越高，但过大时杂质溶出也会增加［9］。最终确定，霍山石斛花总黄酮最优提取工艺为乙醇体积分数66%，微波时间3 min，微波温度74 ℃，液料比56 ∶1，总黄酮提取量为12.23 mg／g。