HPLC 法同时测定金银花配方颗粒中6 种成分

胡 杨李先芝 钱全全严 玲毛琼丽林 露刘 洋石 豪

（1.劲牌有限公司，湖北 大冶435112； 2.中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北 大冶 435112）

金银花是忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒、疏散风热 之功效［1］，主要含 有黄酮［2⁃3］、有 机酸［4⁃5］、多糖［6⁃7］、挥发油［8］、多酚［9⁃10］等成分，在抗炎［11⁃12］、抗氧化［6，13］、抗病毒［14⁃15］、抗癌［16⁃17］、调节免疫力［18⁃19］等方面具有显著功效，正成为研究热点。金银花配方颗粒是以金银花饮片为原料，采用现代工艺技术对其进行提取、浓缩、干燥、制粒、包装等工序加工制成的新型中药制剂，与传统饮片相比，它具有免煎煮、易于携带、安全卫生等优势［20］，但在性状、鉴别上与原药材有较大差异，为了确保其安全有效、质量稳定，对其指标性成分含量进行测定显得尤为重要［21］。目前，对金银花配方颗粒的研究主要集中在指纹图谱或单一成分（如绿原酸、木犀草苷）［22⁃24］，但鲜有同时测定6种绿原酸及其异构体含量的报道。因此，本实验采用HPLC 法同时测定金银花配方颗中绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 的含量，以期为该制剂的质量控制提供有效手段。

1 材料

1.1 仪器 UltiMate 3000 高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）；SQP 电子分析天平（德国赛多利斯公司）；数控超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）；PURELAB classic UV 超纯水仪（英国ELGA 公司）；数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）。

1.2 试剂 绿原酸对照品（批号110753⁃201716，纯度99.3%，中国食品药品检定研究院）；异绿原酸C 对照品（批号250036⁃202005，纯度99.21%，上海鸿永生物科技有限公司）；隐绿原酸（批号DST200522⁃035，纯度98.77%）、新绿原酸（批号DST200521⁃015，纯度99.68%）、异绿原酸A（批号DST190918⁃036，纯度99.55%）、异绿原酸B（批号DST191008⁃037，纯度99.04%）对照品（成都德思特生物技术有限公司）。乙腈为色谱纯（美国费希尔公司）；磷酸为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

1.3 药物 金银花配方颗粒共3 批，由劲牌持正堂药业有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters Atlantis T3 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）⁃0.1%磷酸（B），梯度洗脱，程序见表1；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长348 nm；进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品适量，50%甲醇溶解，制成每1 mL 分别含0.5、0.5、0.3、0.4、0.4、0.3 mg 上述成分的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液 精密称取配方颗粒粉末0.1 g，置于25 mL 量瓶中，20 mL 50%甲醇超声处理30 min，冷却至室温，50%甲醇定容至刻度，摇匀，0.25 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 精密称取麦芽糊精粉末0.1 g，置于25 mL 量瓶中，加20 mL 50%甲醇超声处理30 min，冷却至室温，50% 甲醇定容至刻度，摇匀，0.25 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适应性考察 取对照品、供试品、阴性样品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，供试品、对照品溶液在相同保留时间上都有色谱峰，阴性无干扰。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 线性关系考察 将“2.2.1”项下对照品溶液稀释成5 个质量浓度，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度试验 取同一批配方颗粒（批号C20442001011），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 峰面积RSD 分别为0.27%、0.28%、0.25%、0.18%、1.16%、0.15%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一批配方颗粒（批号C20442001011），于0、4、8、12、16、20 h 在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 峰面积RSD 分别为0.36%、0.27%、0.38%、0.50%、1.06%、0.33%，表明溶液在20 h内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 取同一批配方颗粒6 份（批号C20442001011），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 含量RSD 分别为0.43%、0.38%、0.48%、0.35%、0.77%、0.39%，表 明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 精密量取各成分含量已知的同一批配方颗粒（批号C20442001011）50 mg，置于25 mL 量瓶中，共9 份，分别按低、中、高水平加入对照品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，各成分平均加样回收率（RSD）分别为新绿原酸99.27%（2.49%）、绿原酸99.60%（1.88%）、隐绿原酸98.40%（2.77%）、异绿原酸B 101.17%（1.27%）、异绿原酸A 101.38%（1.28%）、异绿原酸C 99.76%（1.26%）。

2.3.7 样品含量测定 取3 批配方颗粒，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

表3 各成分含量测定结果（mg／g， n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg／g， n＝3）

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法筛选

3.1.1 提取溶剂 考察了甲醇、水、50% 甲醇，发现以水提取时，各成分含量均很低；以甲醇提取时，绿原酸、隐绿原酸含量较低；以50% 甲醇提取时，各成分提取效果最好。因此，选择50% 甲醇作为提取溶剂。

3.1.2 提取方法 考察了超声、加热回流、冷浸，发现加热回流、超声提取效果均较好，冷浸效果最差。为了操作简便，选择超声作为提取方法。

3.2 色谱条件筛选

3.2.1 色谱柱 考察了Waters、Thermo 等不同厂家的色谱柱，发现Waters 色谱柱分离效果最好，重复性理想。

3.2.2 检测波长 将对照品、样品在190～800 nm范围内进行全波长扫描，发现各成分在348 nm 处均有较大吸收峰，而且干扰较小，基线平稳。因此，选择348 nm 作为检测波长。

4 结论

本实验建立了HPLC 法同时测定金银花配方颗粒中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 的含量，该方法操作简便，重复性好，准确度高，可为该制剂的质量监控提供参考。