一测多评法在肺宁口服液品质评价中的应用

徐 云 ，于艳辉 ，牟 荣 ，王宝成 ，苏小红，肖俊美 ，徐 建

（1.吉林修正药业新药开发有限公司，吉林省中药标准化关键工程技术重点实验室，长春130103；2.吉林省药品审评中心，长春130000;3.通药制药集团股份有限公司，通化134000）

肺宁口服液由返魂草的单方制剂。其质量标准为国家药品标准 WS3-083-（Z-017）2005Z，其质量标准中仅包含薄层鉴别及高效液相色谱法绿原酸含量测定，检测成分单一。尚未有关于肺宁口服液绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸含量测定的方法报道，故建立高效液相色谱法对此3种成分同时测定的方法。并采用一测多评法（QAMS）与外标法同时测定11批样品进行对比研究。将一测多评法应用于产品的品质评价中，方法简便、准确、可行，也为其他肺宁制剂的品质评价方法建立提供依据。

1 材料

1.1 仪器

Angilent 1200高效液相色谱仪；Ultimate 3000高效液相色谱仪；梅特勒MS205DU型分析天平；梅特勒TOLEDO XPR2型百万分之一分析天平；SB25-12DT型超声波清洗器。

1.2 试剂与试药

乙腈为色谱纯；甲醇、甲酸、磷酸等均为分析纯；水为纯化水。

1.3 对照品与样品

绿原酸（110753-201817，纯度：96.8%）从中国食品药品检定研究院购入；新绿原酸（HNO21137198，纯度 98%）、隐绿原酸（HCO2134198，纯度 98%）、均从Herbest购入；肺宁口服液 （190309批、191202批、191203批、191204批、191205批、191206批、191207批、191208批、191209批、191210批、191211批），均由通药制药集团股份有限公司提供。

2 方法[1～3]

2.1 色谱条件

采用Agilent ZORBAX SB C18色谱柱 （柱长为250 mm，内径为4.6 mm粒径5μm)；以乙腈为流动相A，以0.2%甲酸溶液为流动相B，按下表中规定进行梯度洗脱；检测波长为325 nm；柱温为35℃，流速0.8 ml/min。理论板数按绿原酸峰计算应不低于5000，详见表1。

表1 流动相洗脱条件

2.2 混合对照品溶液的制备

分别精密称定绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸适量，加甲醇制成浓度分别为含新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的混合溶液，作为储备液。精密量取对照品储备液1 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液制备

精密量取本品2ml，置于25 ml容量瓶中，加70%甲醇20ml，超声20分钟，放冷，加70%甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学

2.4.1 专属性试验

2.4.1.1空白辅料溶液的制备

按处方制备辅料及用量，制备辅料空白样品，再按照2.3项下供试品溶液制备方法，制备空白辅料溶液。

2.4.1.2分别精密吸取空白辅料溶液、空白溶剂（70%甲醇）、供试品溶液、混合对照品溶液（2.2项下）各10 μl，注入液相色谱仪，对比HPLC图。考察方法专属性。空白辅料及空白溶剂均无干扰，结果表明专属性良好。详见图1。

图1 专属性HPLC图

2.4.2 线性与范围

取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸混合对照品（浓度依 次为 0.2915 mg/ml、0.2896 mg/ml、0.2645 mg/ml），分别稀释 2、5、10、20、50 倍。作为对照品溶液，精密吸取上述对照品溶液各5μl，注入液相色谱仪测定峰面积，以峰面积为纵坐标（Y），以对照品浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，分别求出新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的回归方程和r值。结果见表2。

表2 HPLC线性回归方程及线性范围的测定结果

2.4.3 精密度试验

取2.4.2项下稀释10倍的对照品溶液，在2.1项下色谱条件下，连续进样6次，进样体积5μl，测定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的峰面积，计算RSD值。RSD值分别为0.94%、1.09%、1.07%。表明仪器精密度良好。

2.4.4稳定性试验

取供试品溶液（批号：190309批），按照2.1项下色谱条件分别在 0、5、10、15、20、25 小时进样，记录新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸峰面积，分别考察其在溶液中的稳定性。计算新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的RSD分别为0.21%、0.29%、0.34%。表明供试品溶液在25小时内稳定。

2.4.5 重复性试验

精密量取本品（批号：190309）2ml，共 6 份，按 2.3项下供试品溶液制备方法制备，按2.1色谱条件测定其含量，计算新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的平均含量分别为 0.47 mg/ml、0.30 mg/ml、0.33 mg/ml及 RSD 分别为0.19%、0.18%、0.18%。结果表明重复性良好。

2.4.6 回收率试验

精密量取已知含量样品（批号：190309批，含新绿原酸0.47 mg/ml、绿原酸0.37 mg/ml、隐绿原酸0.33 mg/ml）1ml，共 6 份，分别置于 25 ml量瓶中，精密加入混合对照品溶液 （浓度为新绿原酸0.4869 mg/ml、绿原酸 0.3489 mg/ml、隐绿原酸 0.3352 mg/ml）1ml，精密加入20 ml 70%甲醇溶液，超声10分钟，放冷，加70%甲醇溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液测定含量，计算新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸回收率，结果分别为 100.7%～104.6%、95.0%～100.8%、95.7%～101.1%。RSD均小于3%，方法准确度良好。

2.5 相对校正因子的重现性考察[4～6]

取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸混合对照品（浓度依次为 0.2915 mg/ml、0.2896 mg/ml、0.2645 mg/ml），分别稀释5倍（对照溶液1）、10倍（对照溶液2）、20倍（对照溶液3）、50倍（对照溶液4）。按照2.1项下色谱条件，依法测定。分别考察在不同仪器 （戴安U-3000高效液相色谱仪器、安捷伦1200高效液相色谱仪） 不同色谱柱 （Aglient ZORBAX SB-C18（4.6 mm*250 mm，5 μm）、Kromasil 100-5-C18（4.6 mm*250 mm，5 μm）)的峰面积，并计算新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的相对校正因子。结果见表3。

表3 相对校正因子重现性

结果f绿/新平均值=1.268 f绿/隐平均值=1.220

2.6 新绿原酸与隐绿原酸的定位

根据重复性试验及校正因子重现性考察试验结果，记录其新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的保留时间，计算新绿原酸、隐绿原酸与绿原酸的相对保留时间分别为0.64、1.084。不同仪器及色谱柱之间相对保留时间波动较小，RSD值分别为0.34%、0.21%。可采用相对保留时间法对新绿原酸及隐绿原酸进行定位。

2.7 一测多评测法与外标法比较[7～10]

取11批肺宁口服液及10批中间体，按2.3项下制备供试品溶液，以一测多评法和常规外标法进行新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸含量测定比较，并将含量测定结果进行T检验分析。外标法与一测多评法测得的新绿原酸P值为0.893，隐绿原酸的P值为0.926，P＞0.05，说明两种方法之间无显著性差异。进一步验证一测多评法用于新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的测定结果的准确性。结果见表4。

表4 一测多评法与外标法含量测定结果

3 讨论

色谱条件筛选时，分别考察不同浓度的磷酸、甲酸，结果0.2%的甲酸峰型最好。且对不同仪器及不同色谱柱进行重现性考察。分别考察在不同仪器 （戴安U-3000高效液相色谱仪器、安捷伦1200高效液相色谱仪）不同色谱柱 （Aglient ZORBAX SB-C18（4.6 mm*250 mm，5 μm）、Kromasil 100-5-C18（4.6 mm*250 mm，5μm）)相对校正因子具有较好的重现性。根据后续试验相对保留时间数据积累，待进一步规定其相对保留时间及SD值，更加准确的测定其含量。

通过前期对返魂草药材的指纹图谱研究，其新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸3中酚酸类成分含量较高，且通过前期对返魂草药材及肺宁制剂的药效物质基础研究，绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸是止咳、抗炎作用的主要药效成分，绿原酸对照品易得，采用一个对照品来评价多个成分，节约成本，对返魂草及返魂草制剂的品质评价及标准提升提供参考。