菟丝子多酚对衰老小鼠抗氧化能力及免疫调节作用研究

杨 敏，陈佳俊，赵晨旭，赵宏磊，魏兆明

（吉林农业科技学院·吉林吉林·132101）

前言

植物多酚是一类具有清除自由基和抗氧化能力的化合物，在降血糖、降血压、预防心血管疾病等方面发挥重要作用[1]。菟丝子（Cuscuta chinensis Lam.）是种富含黄酮类、多糖类、酚类的植物[2,3]，目前国内外对其研究集中在黄酮类[4]、多糖[5]成分鉴定及其生殖、抗衰等方面，而关于菟丝子中多酚化合物抗氧化及免疫调节作用的研究少见报道。在合理利用药物资源及寻求和扩大新药源的前提下,本试验通过建立氧化衰老模型考察菟丝子多酚抗氧化能力及免疫调节作用，以期为菟丝子的进一步开发利用奠定基础，亦为开发利用长白山药用资源提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 试验动物

SPF级昆明种小鼠60只，健康状况良好（由长春市宽城区宏达动物养殖场提供）。

1.2 药品

菟丝子 （购自深圳市欣辉安贸易有限公司）；D-半乳糖（购自索莱宝生物科技有限公司）；维生素E(购自吉林恒星科技制药有限公司)。

1.3 主要试剂

SOD试剂盒、MDA试剂盒、NO试剂盒（购自南京建成科技有限公司）；IL-1试剂盒、IL-2试剂盒（购自上海仁捷生物科技有限公司）。

1.4 主要仪器

真空冷冻干燥机 （购自EYELA東京理化器械株式会社）；离心机（购自东京HITACHI跨国集团）；酶标仪（购自上海美谷分子仪器有限公司）。

2 操作方法

2.1 药材预处理

菟丝子→乙醇水浴提取→真空抽滤→分离→纯化→定容→稀释→样品

2.2 动物模型建立及分组给药

动物选用昆明种小鼠，雌雄兼有，造模药物进行先期配置，将D-半乳糖溶于生理盐水中，配成体积浓度为20mg/ml,储存于4℃冰箱备用。维生素E（VE）配制：将VE胶丸用玉米油配制成20 mg/ml的药液,储存于4℃冰箱备用。

小鼠随机分为 6 组:空白组（C）、模型组（M）、低剂量组 100 mg/kg（D）、中剂量组 200 mg/kg（Z）、高剂量组 300mg/kg（G），VE 对照组（VE），每组 10 只。 除 C外，其他各组小鼠每日腹腔注射D-半乳糖200mg/kg,一日1次,连续4w,C组注射等体积生理盐水。同时低、中、高组，每日1次，灌胃给药，C组和M组给予同体积的0.9%生理盐水，连续6w。

2.3 菟丝子多酚对D-半乳糖衰老小鼠抗氧化能力的影响

2.3.1 血清的制备

眼球采血，将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时，在3500rpm、4℃条件下离心15分钟，取上清液。

2.3.2 MDA含量的测定（硫代巴比妥酸法）

过氧化脂质降解产物中的MDA与硫代巴比妥酸缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰，用此法测MDA含量。计算公式如下：

MDA血清（nmol/ml）=[（OD测定-OD对照）/（OD标准-OD空白）]×C标准品×稀释倍数样本测试前

2.3.3 SOD活性测定

采用水溶性四唑盐（WST-1）法。在本反应体系中SOD抑制率达50%时所对应的酶量为一个SOD活力单位(U)。计算公式如下：

SOD抑制率（%）=[（A对照-A对照空白）-（A测定-A测定空白）]/（A对照-A对照空白）×100%

SOD活力（U/ml）=SOD抑制率/50%×稀释倍数反应体系×稀释倍数样本测试前

2.4 菟丝子多酚对D-半乳糖小鼠免疫调节作用的影响

用预冷的 PBS（缓冲液，0.01M，pH=7.4）冲洗脾脏和胸腺，去除残留血液，称重后将组织剪碎，在与PBS以重量体积1∶9的比例，放入匀浆材料中，于冰上充分研磨，对匀浆液超声破碎，5000rpm、4℃下离心10分钟，取上清检测。

2.5 菟丝子多酚对小鼠胸腺组织NO、IL-1功能的影响

计算公式：

NO（μmol/L）=[（OD测定-OD空白）/(OD标准-OD空白）]×C标准品×稀释倍数

IL-1测定采用ELISA法,酶标仪在450nm波长下测定吸光值（OD值）计算样品浓度。

2.6 菟丝子多酚对小鼠脾脏组织IL-2功能的影响

检测方法与IL-1类似。

2.7 统计学处理

SPSS19.0软件，统计法应用单因素方差分析。

3 结果与分析

3.1 模型小鼠生长发育情况分析结果

表1 小鼠造模期间形态统计

D、Z组小鼠相比M组，毛态顺亮，进食多，重量大，生活状态明显更有生命力，而M组生活状态明显不佳，证明造模成功，指示D、Z组对衰老小鼠有明显改善。G组表现低迷，指示高剂量组改善作用不明显或对小鼠不利。

3.2 抗氧化指标含量测定结果

表2 菟丝子多酚抗氧化能力 n=5（±s）

表2 菟丝子多酚抗氧化能力 n=5（±s）

注：#：表示与空白组相比较，P＜0.05；##：表示与空白组相比较，P＜0.01；*： 表示与模型组相比较，P＜0.05；**：表示与模型组相比较，P＜0.01；n=5。

组别 MDA(nmol·ml-1) SOD(U·ml-1)C 3.28±1.04 23.42±1.38 M 9.17±0.46## 13.58±0.74##D 7.67±0.71** 15.25±0.46*Z 5.75±0.70** 15.54±1.56*G 8.72±0.71 13.70±1.06 VE 3.68±0.80** 19.39±1.29**

由表2可知，M组相比C组，MDA含量极显著（P＜0.01）增加，SOD 活力极显著（P＜0.01）下降；D、Z、VE 组较 M 组，MDA 含量显著（P＜0.05）降低，SOD 活力显著（P＜0.05）提升；G组与M组MDA含量和SOD含量无显著性（P＞0.05）差异。表明低、中剂量的菟丝子多酚提取物可能对衰老有一定的抗氧化作用。

3.3 免疫指标测定结果

表3 菟丝子多酚对免疫的影响n=5（±s）

表3 菟丝子多酚对免疫的影响n=5（±s）

组别 IL-1（pg·ml-1） IL-2（pg·ml-1） NO(μmol·L-1)C 127.37±4.15 127.37±4.15 24.80±1.91 M 90.12±2.99## 89.72±3.26## 39.70±3.14##D 95.62±1.73* 107.02±4.60** 36.68±1.47*Z 110.30±6.06** 114.30±5.44** 30.81±1.67**G 92.91±3.29 92.91±3.29 37.41±1.82 VE 121.90±4.47** 125.90±8.44** 26.69±2.60**

由表3可知，M组相比C组,IL-1、IL-2的水平极显著（P＜0.01）降低，NO 水平极显著（P＜0.01）提高；D组较 M 组，IL-1 水平显著（P＜0.05）提高，IL-2 水平极显著（P＜0.01）提高，NO 水平显著（P＜0.05）下降；Z、VE组较M组，IL-1水平、IL-2水平极显著 （P＜0.01）提高，NO水平极显著（P＜0.01）下降；G组与M组比较，3个指标均无显著性（P＞0.05）差异。表明D、Z剂量菟丝子多酚提取物能够调控衰老模型小鼠免疫系统。

4 讨论

本研究通过D-半乳糖建立衰老小鼠模型，生活能力明显弱化，与C组区别较大，造模顺利。模型小鼠抗氧化指标和免疫指标含量明显下降，自由基含量明显增加，指示小鼠衰老同时对氧化应激和免疫调节产生了影响。本课题研究显示，菟丝子多酚低、中剂量对衰老促进剂D-半乳糖有拮抗作用，可以提高小鼠抗氧化和促进免疫因子的释放，抑制自由基产生从而减少对小鼠造成伤害，促进免疫系统分泌免疫因子，实现保护机体的作用。