POT1-AS1在胃腺癌组织中的表达及其对细胞增殖的影响

贺海斌 张智勇 赵伟

胃腺癌（gastric adenocarcinoma,GAC）是常见的恶性肿瘤之一[1]，目前最有效的治疗方法是手术治疗，但部分患者在诊断时已处于晚期，失去最佳手术治疗时机，且预后较差[2]。因此，探索GAC发生、发展的分子机制，寻找新的早期诊断及治疗靶点是目前GAC研究的重点[3-4]。长期以来，长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一种不编码蛋白质、长度＞200个核苷酸的RNA，广泛分布在基因组中。目前认为lncRNA是基因组调节机制的重要组成部分[5]。也有证据表明，某些lncRNA在癌症中失调，并在表观遗传调控、基因转录调控以及其他与肿瘤发生、侵袭有关的生物学过程中发挥重要作用[6]。近年来，lncRNA在胃肠道癌症发生、发展中的分子机制是研究热点[7]。POT1-AS1是一种lncRNA，其在GAC中的表达谱和潜在机制目前尚未知晓。因此，本研究对POT1-AS1在GAC组织中的表达及其对细胞增殖的影响作一探讨，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2016年6月至2018年12月在西安交通大学第一附属医院普通外科手术切除的80对GAC组织及其癌旁正常组织标本，立即存于多聚甲醛溶液中；所有患者术前未接受过放、化疗等辅助治疗。所有入组患者签署知情同意书。正常人胃黏膜上皮细胞GES-1和 GAC 细胞株 BGC-823、MGC-803、MKN45、SGC-7901均购自中国科学院上海生命科学研究所细胞资源中心。本实验经西安交通大学第一附属医院和宁波市医疗中心李惠利医院医学伦理委员会审查通过。

1.2 细胞培养及转染 将正常人胃黏膜上皮细胞GES-1和 GAC 细胞株 BGC-823、MGC-803、MKN45、SGC-7901置于 37℃、5% CO2的培养箱中，用含 10% FBS的DMEM培养基（批号：SH30022.01，美国HyClone公司）培养。当细胞生长至约60%融合度时，按照Effectene Transfection Reagent（批号：301425，德国 Qiagen 公司）说明书步骤将sh-POT1-AS1质粒转染至SGC-7901细胞中，即POT1-AS1敲低。

1.3 组织及细胞中POT1-AS1 mRNA相对表达量检测 采用RT-qPCR法。Trizol法提取GAC组织及其癌旁正常组织和 GAC细胞系 GES-1、BGC-823、MGC-803、MKN45、SGC-7901中的RNA，按照RNA逆转录试剂盒（美国Thermo Scientific公司）说明书步骤将RNA逆转录为cDNA，按照qPCR试剂盒（瑞士Roche公司）说明书步骤进行PCR。PCR条件：95℃10 min预变性，95℃ 5 s变性，60℃ 30 s退火，72℃ 30 s延伸循环40次；引物序列正义为GGCCATTACCCCTCCACTTG，反义为 TGTTGGGTATGCACCTCCAC。采用2-ΔΔCt法计算 POT1-AS1 mRNA相对表达量。

1.4 GAC细胞增殖能力检测 （1）采用CCK-8试验。将SGC-7901细胞（包括POT1-AS1敲低组、未敲低组）以2 000个/孔的密度接种在96孔板中，在恒温培养箱中培养 0、24、48、72 h，然后每孔加入 10 μl CCK-8 试剂（批号：CX001M，上海雅酶生物科技有限公司），37℃孵育1 h，使用酶标仪（美国Molecular Devices公司）检测450 nm处的吸光度（OD450）。（2）采用平板克隆试验。将SGC-7901细胞（包括POT1-AS1敲低组、未敲低组）以1 000个/孔的密度接种在6孔板中，在恒温培养箱中培养14 d，然后用甲醛溶液固定，结晶紫染色，相机拍照并计数。

1.5 细胞周期相关蛋白表达检测 采用Western blot法。使用RIPA裂解液提取SGC-7901细胞（包括POT1-AS1敲低组、未敲低组）蛋白样品，使用BCA定量试剂盒（批号：P0010，上海碧云天生物技术有限公司）检测蛋白样品浓度。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（美国BIORAD公司）将蛋白样品分离后转至PVDF膜上，10%脱脂牛奶封闭后用一抗和相应的二抗孵育。最后用ECL发光液（批号：WBLUF0500，美国Millipore公司）显影，应用Image J软件（美国NIH公司）进行Western blot图片条带灰度值分析，蛋白相对表达量=（转染组蛋白条带灰度值/转染组内参条带灰度值）/（未转染组目的蛋白条带灰度值/未转染组内参条带灰度值）。细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、细胞周期蛋白依赖性激酶4（cyclin dependent kinase 4,CDK4）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A,CDKI1A）等抗体均购自英国Abcam公司，批号分别为ab134175、ab108357、ab109520；β-actin 抗体购自美国Proteintech公司，批号为66009-1-Ig。

1.6 统计学处理 采用GraphPad Prism 8.0统计软件。符合正态分布的计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验；两组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GAC组织与癌旁正常组织中POT1-AS1 mRNA相对表达量比较 80例GAC患者CAC组织中POT1-AS1 mRNA相对表达量明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 1。

图1 GAC组织与癌旁正常组织中POT1-AS1 mRNA相对表达量比较（GAC为胃腺癌）

2.2 GAC细胞系与正常人胃黏膜上皮细胞中POT1-AS1 mRNA相对表达量比较 GAC细胞系BGC-823、MGC-803、MKN45、SGC-7901 中 POT1-AS1 mRNA 相对表达量均明显高于正常人胃黏膜上皮细胞GES-1，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图2。

图2 GAC细胞系与正常人胃黏膜上皮细胞中POT1-AS1 mRNA相对表达量比较（GAC为胃腺癌；与GES-1比较，*P＜0.05）

2.4 sh-POT1-AS1质粒转染对SGC-7901细胞中POT1-AS1 mRNA相对表达量的影响 sh-POT1-AS1质粒转染后，SGC-7901细胞中POT1-AS1 mRNA相对表达量明显低于未转染组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图3 sh-POT1-AS1质粒转染对SGC-7901细胞中POT1-AS1 mRNA相对表达量的影响（与未转染组比较，*P＜0.05）

2.5 POT1-AS1敲低对SGC-7901细胞增殖能力的影响 CCK-8试验结果显示，POT1-AS1敲低组SGC-7901细胞增殖能力明显低于未敲低组，差异有统计学意义（P＜0.05）；采用平板克隆试验作进一步验证，结果显示POT1-AS1敲低组SGC-7901细胞克隆数明显少于未敲低组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。

图4 POT1-AS1敲低对SGC-7901细胞增殖能力的影响（a：CCK-8试验结果；b：平板克隆试验结果；与未敲低组比较，*P＜0.05；OD450为450nm处的吸光度）

2.6 POT1-AS1敲低对SGC-7901细胞中细胞周期相关蛋白相对表达量的影响 POT1-AS1敲低后，SGC-7901细胞中Cyclin D1、CDK4蛋白相对表达量较未敲低组明显降低，而CDKI1A蛋白相对表达量较未敲低组明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图5。提示POT1-AS1促进GAC细胞周期进展。

图5 POT1-AS1敲低对SGC-7901细胞中细胞周期相关蛋白相对表达量的影响（Cyclin D1为细胞周期蛋白D1；CDK4为细胞周期蛋白依赖性激酶4；CDKI1A为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A；β-actin为β-肌动蛋白；与未敲低组比较，*P＜0.05）

3 讨论

GAC是我国常见、多发的恶性肿瘤，复发和转移是其预后不良的重要原因。早期诊断并及时治疗能有效改善GAC患者的预后，提高远期生存率。因此，进一步探索GAC发病的分子机制、诊断和治疗分子靶点是目前GAC研究的重点。lncRNA作为一种广泛存在的非编码RNA，参与调控细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程[8]。研究表明，lncRNA在GAC发生、发展中起重要作用，如IGF2-AS通过吸附miR-503调节SHOX2，从而影响GAC转移[9]；LIFR-AS1通过miR-29a-3p/COL1A2促进胃癌细胞增殖和侵袭[10]；LINC01667通过miR-138-5p/Cyclin E1影响胃癌增殖[11]；LINC00641通过miR-582-5p启动自噬，从而影响GAC细胞对奥沙利铂的耐药性[12]；RPLP0P2促进胃癌细胞增殖[13]。目前关于POT1-AS1在GAC中的表达与功能尚无相关研究，故本研究作了相关探索，结果发现POT1-AS1在GAC组织及细胞系中呈高表达。经sh-POT1-AS1质粒转染（即POT1-AS1敲低）后，SGC-7901细胞中POT1-AS1 mRNA相对表达量明显低于未转染组，差异有统计学意义。然后经CCK-8试验和平板克隆试验证实POT1-AS1可抑制GAC细胞增殖能力。进一步探寻POT1-AS1抑制GAC细胞增殖能力的机制，结果发现在GAC细胞中敲低POT1-AS1可抑制CDK4、Cyclin D1蛋白表达并促进CDKI1A蛋白表达，进而阻碍细胞周期进展，抑制细胞增殖。

综上所述，GAC组织及细胞系中POT1-AS1 mRNA相对表达量均明显升高；在GAC细胞中敲低POT1-AS1可抑制CDK4、Cyclin D1蛋白表达并促进CDKI1A蛋白表达，进而抑制细胞增殖。笔者认为POT1-AS1可作为新的GAC分子标志物或治疗GAC潜在的分子靶点，具有重要的临床意义。