甘露糖受体与慢性乙肝患者肝纤维化的关系研究

李阿利 虞邦映 邵辉 陈华忠 章霞 温寿向 朱坚胜

我国是全球乙肝感染率最高的国家之一。据报道，2016年我国慢性乙肝（chronic hepatitis B,CHB）患者约达3 000万例[1]。肝纤维化是各种病因引起的慢性肝脏损伤后的瘢痕修复反应，是疾病进展为肝硬化的必经阶段[2]，而肝星状细胞激活是肝纤维化发生、发展的核心步骤[3]。甘露糖受体（mannose receptor,MR）是一种模式识别受体，在识别病原体、诱导细胞因子生成和保持机体内环境稳定中发挥重要作用，具有清除胶原蛋白的功能，与肝纤维化的形成密切相关[4]。近年来，MR成为国内外研究的热点，关于MR与肝脏疾病的相关研究越来越多，但其与CHB患者肝纤维化关系研究较少。本研究采用免疫组化法和RT-PCR法检测MR在CHB肝纤维化不同分期患者肝组织中的表达，以探讨其在肝纤维化发生、发展过程中的作用，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2016年11月至2018年10月在浙江省台州医院感染科住院且行肝脏穿刺活检的CHB患者 50例，其中男 28例，女22例；年龄 32～59（42.61±7.25）岁；肝纤维化分期：S0期 15 例，S1～2期 20 例，S3～4期15例。CHB肝纤维化不同分期组患者性别、年龄比较，差异均无统计学意义（均 P ＞0.05）；ALT、AST、PLT 比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。纳入标准：（1）年龄 30～60岁；（2）符合 2015年 CHB 防治指南中相关诊断标准[5]；（3）经B超定位引导下肝脏穿刺活检术后肝组织病理学诊断明确为CHB。排除标准：（1）合并 HAV、HCV、HDV、HEV、HIV 感染；（2） 患有脂肪肝、酒精性肝病、自身免疫性肝病、肝硬化、肝恶性肿瘤、遗传代谢性肝病等疾病；（3）既往或近期接受过抗病毒治疗；（4）妊娠或哺乳期妇女；（5）患有甲状腺功能亢进症、糖尿病等代谢疾病；（6）患有严重的心、肺、脑、肾等重要脏器疾病。本研究经本院医学伦理委员会审查通过，所有患者签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 肝纤维化分级评估 在超声定位下，采用16 G穿刺针进行肝脏穿刺活检术。取组织标本长度＞1 cm，常规行HE染色，由2位高年资病理科医生独立阅片进行诊断。参照2015年CHB防治指南[5]和1995年国际认可的Scheuer评分系统[6]对肝组织进行纤维化分期，分为S0～4期。其中S0期为无纤维化，S1～2期为轻度纤维化，S3～4期为中重度纤维化。

1.2.2 肝组织MR蛋白表达检测 采用免疫组化法。将肝组织置于60℃恒温烤箱中预热2 h，切片，铺平，常规脱蜡至水，梯度乙醇脱水；置于PBS中，冲洗3次，5 min/次；0.3% H2O2、37 ℃恒温箱中孵育 15 min，消除内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗3次，5 min/次；0.01 M枸橼酸钠进行抗原热修复，高压15 min，自然冷却至室温，PBS冲洗3次，5 min/次；滴加兔抗人 MR抗体（1∶800一抗稀释液稀释），4℃冰箱内孵育过夜，PBS冲洗3次，5 min/次；滴加兔鼠通用型二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗3次，5 min/次；DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片，在光镜下观察并拍照。判读标准：在光镜下观察，细胞质或细胞膜上棕黄色颗粒提示MR阳性表达细胞。每张切片随机选取5个高倍镜视野，每个视野下计算100个细胞中MR阳性表达细胞数，计算阳性细胞百分比并取平均值。染色强度评分：无染色为0分，浅黄色染色为1分，棕黄色染色为2分，棕褐色染色为3分；阳性细胞百分比评分：0%为0分，1%～为1分，26%～为2分，51%～为3分，76%～100%为4分；免疫组化评分为染色强度评分与阳性细胞百分比评分的乘积。根据免疫组化评分评估MR蛋白表达强度：＜2分为（-），2～3分为（+），4～6 分为（++），＞6分为（+++）。

1.2.3 肝组织 MR、NF-κB、转化生长因子-β1（transforming growth factor,TGF-β1）、α-平滑肌肌动蛋白（αsmooth muscle actin,α-SMA）mRNA表达检测 采用RT-PCR法。采用Trizol法提取肝组织总RNA，按照两步法RT-PCR试剂盒操作说明进行cDNA逆转录与PCR扩增，将PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳后，观察扩增条带。引物序列见表2。采用2-ΔΔCt法计算肝组织 MR、NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA 相对表达量，所有样本均重复3个孔，取平均值。

表2 MR、α-SMA、NF-κB、TGF-β1及内参GAPDH引物序列

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料组间比较采用χ2检验；等级资料组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，两两比较采用Nemenyi检验。计量资料双变量之间的相关性分析采用Pearson相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CHB肝纤维化不同分期组患者MR蛋白表达比较 MR在CHB肝纤维化不同分期组肝组织上均有表达，主要表达于肝血窦内巨噬细胞的胞膜和胞质上，在肝脏内皮细胞、淋巴细胞的胞膜和胞质中也有部分表达，染色清晰，免疫组化结果见图1（插页）。随着肝纤维化程度的加重，MR表达逐渐增强（P＜0.05），见表3。

表3 CHB肝纤维化不同分期组MR蛋白表达强度比较（例）

2.2 CHB肝纤维化不同分期组肝组织MR、NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA表达比较 CHB肝纤维化不同分期组肝组织 MR、NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA表达比较，差异均有统计学意义（F=32.50、24.35、96.42、54.37，均 P＜0.05）；与 S0组比较，S1～2组、S3～4组肝组织MR、NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA 表达均明显增加（均 P＜0.05）；与 S1～2组比较，S3～4组肝组织 MR、NF-κB、TGF-β1、α-SMA 表达均明显增加（均 P＜0.05），见图 2。2.3 CHB患者肝组织MR mRNA表达与NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA表达的相关性 CHB患者肝组织MR mRNA 表达与 NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA 表达均呈正相关（r=0.653、0.811、0.785，均 P＜0.05），见图 3。

图2 CHB肝纤维化不同分期组肝组织MR、NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA表达比较（CHB为慢性乙肝；MR为甘露糖受体；TGF-β1为转化生长因子-β1；α-SMA为α-平滑肌肌动蛋白；*P＜0.05）

图3 CHB患者肝组织MR mRNA表达与NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA表达相关性的散点图（CHB为慢性乙肝；MR为甘露糖受体；TGF-β1为转化生长因子-β1；α-SMA为α-平滑肌肌动蛋白）

3 讨论

慢性HBV感染是全球公共卫生问题之一。据WHO报道，全球HBV感染率约为3.5%[7]。据中国疾病预防控制中心统计，自1992年全面实行乙肝疫苗接种后，虽然母婴垂直传播率和婴幼儿时期HBV感染率明显降低，但是我国HBV携带者的比例仍较高[8]。

肝纤维化是CHB发展至肝硬化、终末期肝病甚至肝细胞癌的重要阶段[9-10]。肝星状细胞的活化是导致肝纤维化发展的关键环节[4]。TGF-β1是导致肝纤维化的关键因子，能激活肝星状细胞并使之发生表型改变，从而表达大量α-SMA，促进细胞外基质的过度沉积与生成，最终形成肝纤维化[11-12]。另外，NF-κB具有转录激活功能，参与肝星状细胞的活化调节，对纤维化的发生、发展起着重要作用[13]。本研究结果发现，肝组织NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA表达随着肝纤维化程度增加而升高，进一步证实 TGF-β1、α-SMA、NF-κB 与肝纤维化严重程度密切相关。

MR是一种Ca2+依赖的1型跨膜蛋白受体，主要表达于巨噬细胞以及未成熟树突状细胞等免疫细胞表面，在调节免疫应答和维持糖蛋白稳态方面发挥重要作用[14]。MR结构中的FNⅡ成分可结合Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白，具有清除胶原蛋白的功能，与肝纤维化发生、发展密切相关[5]。近年来，MR与肝脏疾病的研究也取得了一些进展。Ren等[15]研究发现，MR在肝癌组织中的表达明显高于正常癌旁组织中的表达，且在肝硬化、TNM分期差、Child Pugh级别高的肝癌患者中表达更强；此外，肝癌组织中MR高表达者总生存率和无病生存率明显降低。本研究采用免疫组化法检测肝组织MR蛋白表达，发现MR主要表达在巨噬细胞的胞质和胞膜上，肝内皮细胞、淋巴细胞上也有分布；在S0期患者中有少量MR表达，在S1～4期患者中MR蛋白表达随着肝纤维化程度的增加而增强。同时本研究还采用RT-PCR法进一步检测了肝组织中MR mRNA表达，与免疫组化结果一致。

NF-κB在巨噬细胞中的激活后，可以在某些病理条件下将巨噬细胞驱动至M1或M2极化，并在疾病进展或消退中发挥重要作用[16]。Yeh等[17]研究发现三氧化矿物聚集体能通过 Axl、Akt、IKKa/b、IkBa 和 p65 的磷酸化激活Axl/Akt/NF-κB信号通路，诱导巨噬细胞向M2表型极化，上调 IL-10、TGF-β1、MR 表达，其中 MR表达呈时间依赖性增加；而AXL/Akt/NF-κB抑制剂可抑制M2相关细胞因子表达，使MR表达减少。NF-κB是M2巨噬细胞表型的关键调控因子，MR通常被认为是M2巨噬细胞的表面标志物，笔者推测MR与NF-κB可能共同参与疾病的发生、发展。本研究相关性分析结果显示，MR mRNA 表达与 NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA表达呈高度正相关，提示MR可能通过NF-κB通路参与肝纤维化的发生、发展。

综上所述，随着肝纤维化程度的增加，CHB患者肝组织 MR 表达逐渐上调，且与 NF-κB、TGF-β1、α-SMA表达均呈正相关。笔者推测MR可能通过NF-κB通路参与肝纤维化的发生、发展，但其调控作用及具体机制有待后续细胞及动物实验作进一步证实。