利拉鲁肽基于 NF-κB/NLRP3通路介导的焦亡途径对小鼠动脉粥样硬化的干预作用研究

陈金晖 陈青青 梅统 王伟林 张岚 卢永明

动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是心血管疾病的病理基础，是心血管疾病相关死亡的重要原因[1]。AS特征是弹性动脉内膜中纤维组织和脂质的沉积，导致血栓形成和以血管壁增厚和硬化为特征的结构破坏[2]。研究发现，动脉内皮细胞焦亡与AS的发生、发展密切相关[3]。细胞焦亡是近年研究发现的一种程序性细胞死亡新形式——细胞炎性死亡，作为固有死亡的一种形式，可参与AS的形成、发展并影响斑块的稳定性[4]。因此，防治AS的发生与发展，探究内皮细胞焦亡的发生机制或可作为重要突破口。NF-κB信号通路异常是导致AS形成的一个重要影响因素，它涉及AS形成过程中的多种病理过程[5]。NOD样受体蛋白3（nod-like receptor protein 3,NLRP3）炎症小体为先天的免疫信号复合物，其激活可通过不同的信号通路促进AS[6]。胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1,GLP-1）作为一种内源性促胰岛素激素，具有良好的降糖活性。Patel等[7]研究发现，GLP-1激动剂长期治疗可改善饮食引起的血脂异常和AS。目前，关于GLP-1通过NF-κB/NLRP3通路对AS的作用机制研究少见。基于此，本研究采用GLP-1类似物利拉鲁肽干预载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠AS模型，通过基于NF-κB/NLRP3通路介导的焦亡途径分析利拉鲁肽干预对AS小鼠的保护作用，为AS的治疗提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6周龄SPF级雄性ApoE-/-小鼠（品系C57BL/6J）及C57BL/6J正常小鼠，体质量18～20 g，均购自杭州子源实验动物科技有限公司，动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0004，动物使用许可证号：SYXK（浙）2019-0024，动物质量合格证号：SL304725。所有动物饲养在12 h光/暗周期中，自由进食、进水，温度为（20±2）℃，湿度为（50±5）%。

1.1.2 主要试剂和仪器 普通饲料（批号：D12325）和高脂饲料（批号：D12492）均购自上海睿安生物科技有限公司；利拉鲁肽注射液（批号：20200509）购自诺和诺德（中国）制药有限公司；GLP-1受体抑制剂exendin（9-39）（批号：HY-P0293）购自美国 APExBIO 公司；IL-6 ELISA 试剂盒（批号：ab178013）、IL-1β ELISA 试剂盒（批号：ab197742）、TNF-α ELISA 试剂盒（批号：ab181421）均购自美国Abcam公司；HDL-C测定试剂盒（批号：A112-1-1）、LDL-C 测定试剂盒（批号：A113-1-1）、TG测定试剂盒（批号：A110-1-1）、TC测定试剂盒（批号：A111-1-1）均购自南京建成生物工程研究所；HE染色试剂盒（批号：C0105）购自上海碧云天生物科技有限公司；凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC）一抗（批号：67824）、半胱天冬酶-1（Caspase-1）一抗（批号：24232）、NLRP3 一抗（批号：15101）、NF-κB p65 一抗（批号：8242）、p-NF-κB p65一抗（批号：3033）、β-actin一抗（批号：6037）及羊抗小鼠二抗（批号：7074）均购自美国Cell Signaling Technology公司；酶标仪（型号：VICTOR X）购自德国Perkin Elmer公司；光学显微镜（型号：Ni-E）购自日本Nikon公司；蛋白电泳仪（型号：DYCZ-40B）购自上海启闵生物科技有限公司；凝胶成像仪（型号：GIS-630）购自杭州Miulab公司。

1.2 方法

1.2.1 AS小鼠模型的构建与分组 取12只C57BL/6J正常小鼠作为普通饮食组，即对照组（A组）。36只ApoE-/-小鼠随机分成高脂饮食组即AS模型组（B组）、高脂饮食＋利拉鲁肽组（C组）和高脂饮食＋利拉鲁肽＋GLP-1受体抑制剂 exendin（9-39）组（D 组），每组12只。A组小鼠以普通饲料喂养，B、C、D组小鼠以高脂饲料（1%胆固醇＋15%猪油）喂养，饮用水均为蒸馏水，喂养过程中，饮水及饲料不限量[8]。AS小鼠造模成功标准：HE染色镜下观察到小鼠主动脉血管壁明显增厚，有斑块形成，管腔狭窄，局部有钙化颗粒物沉淀[9]。C组小鼠在喂养高脂饲料的同时，每天背部皮下注射0.6 mg/kg利拉鲁肽（约0.5 ml）[10]，D组小鼠背部皮下注射0.6 mg/kg利拉鲁肽＋22 mol/kg exendin（9-39）（约 0.5 ml），A 组和B组小鼠背部皮下注射0.5 ml的0.9%氯化钠注射液。所有小鼠均饲养在实验室SPF级动物房。小鼠每周称重1次，并及时更换垫料。

1.2.2 样本采集 各组小鼠饲养至18周龄后，摘眼球取血，离心取上清液，置于-20℃中保存备用。然后颈椎脱位处死小鼠，在无菌超净工作台上打开小鼠胸腔、腹腔，取升主动脉根部及下端至膈的主动脉组织，用无菌0.9%氯化钠溶液冲洗。剪取距升主动脉根部约0.5 cm的动脉组织置于4%多聚甲醛中固定，用于病理学观察；然后仔细剥离出其余主动脉组织的内膜，液氮速冻后置于-80℃冰箱中保存备用。

1.2.3 血清炎性因子水平检测 采用ELISA试剂盒对各组小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平进行检测，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。

1.2.4 血清中血脂水平检测 根据试剂盒说明书操作，对各组小鼠血清中HDL-C、LDL-C、TG、TC的水平进行检测。

1.2.5 主动脉病理学观察 取出升主动脉根部组织，脱水透明，浸蜡包埋，切片，HE染色，于光学显微镜下观察，并利用Image J软件分析各组小鼠主动脉内膜中层厚度（intima-media thickness,IMT）及主动脉AS面积与所取血管面积比值。

1.2.6 主动脉内膜 NF-κB p65、p-NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表达水平检测 采用Western blot法。取出主动脉内膜组织，匀浆后提取总蛋白，BCA法检测蛋白含量，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转膜封闭加一抗（NF-κB p65、p-NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、ASC、β-actin，稀释倍数均是 1∶500），4 ℃条件下孵育过夜，洗膜后加入二抗（1∶3 000），室温孵育 2 h，洗膜显色曝光，使用凝胶成像系统观察并以β-actin为内参蛋白，分析各蛋白的相对表达水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件；计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α 水平比较 与A组相比，B组和D组小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平均升高（均P＜0.05）；与B组相比，C组小鼠血清中 IL-6、IL-1β、TNF-α 水平均降低（均 P＜0.05）；与 C组相比，D组小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平均升高（均 P＜0.05）。见表 1。

表1 4组小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平比较（pg/ml）

2.2 4组小鼠血清HDL-C、LDL-C、TG、TC水平比较 与A组相比，B组和D组小鼠血清LDL-C、TG、TC水平均升高（均 P＜0.05），HDL-C 水平均降低（均 P＜0.05）；与B组相比，C组小鼠血清LDL-C、TG、TC水平均降低（均 P＜0.05），HDL-C水平升高（P＜0.05）；与C组相比，D组小鼠血清LDL-C、TG、TC水平均升高（均P＜0.05），HDL-C水平降低（P＜0.05）。见表2。

表2 4组小鼠血清HDL-C、LDL-C、TG、TC 水平比较（mmol/L）

2.3 4组小鼠主动脉病理学变化比较 A组小鼠主动脉血管壁未见明显改变；B组小鼠主动脉血管壁明显增厚，管腔狭窄，可见大量斑块形成，有大量炎性细胞浸润及脂质沉淀；C组小鼠主动脉亦可见血管壁增厚，斑块形成，但与B组相比，增厚程度明显减轻，斑块面积显著减小，仅可见少量炎性细胞浸润；D组小鼠主动脉血管壁增厚程度、斑块形成面积及炎性细胞浸润数量介于B组、C组之间，见图1（插页）。与A组相比，B组和D组小鼠主动脉IMT均升高（均P＜0.05）；与B组相比，C组小鼠主动脉IMT水平降低（P＜0.05）；与C组相比，D组小鼠主动脉IMT水平升高（P＜0.05）；见表 3。

表3 4组小鼠主动脉IMT比较（mm）

2.4 4组小鼠主动脉AS面积与所取血管面积比值比较 与A组相比，B组和D组小鼠主动脉AS面积与所取血管面积比值均升高（均P＜0.05）；与B组相比，C组小鼠主动脉AS面积与所取血管面积比值降低（P＜0.05）；与C组相比，D组小鼠主动脉AS面积与所取血管面积比值升高（P＜0.05）。见表4。

表4 4组小鼠主动脉AS面积与所取血管面积比值比较（%）

2.5 4 组小鼠主动脉内膜 NLRP3、Caspase-1、ASC、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表达水平比较 与A组相比，B组和D组小鼠主动脉内膜NLRP3、Caspase-1、ASC、p-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白表达水平均升高（均P＜0.05）；与B组相比，C组小鼠主动脉内膜NLRP3、Caspase-1、ASC、p-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白表达水平均降低（均P＜0.05）；与C组相比，D组小鼠主动脉内膜 NLRP3、Caspase-1、ASC、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达水平均升高（均P＜0.05）。见图2。

图2 4组小鼠主动脉内膜NOD样受体蛋白3（NLRP3）、半胱天冬酶 -1（Caspase-1）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、NF-κB p65 蛋白表达水平比较（a：蛋白表达电泳图；b：蛋白表达水平比较；与A组比较，*P＜0.05；与B组比较，△P＜0.05；与 C 组比较，▲P＜0.05）

3 讨论

AS是心血管疾病的重要病理生理过程，涉及先天性和适应性免疫炎症机制参与，是当今世界心血管疾病和死亡的主要原因[11]。本研究中给予ApoE-/-小鼠高脂饮食饲养以构建AS小鼠模型，结果发现，AS小鼠主动脉在光学显微镜下可见血管壁明显增厚，管腔狭窄，并有大量斑块及炎性浸润，主动脉IMT、主动脉AS面积与所取血管面积比值及血清中LDL-C、TG、TC水平升高，HDL-C水平降低，揭示AS小鼠模型构建成功。

越来越多证据表明，炎症与AS的进展密切相关。在AS的发生、发展过程中，各种炎症细胞和炎性介质在脂肪条纹以及纤维斑块、动脉粥样硬化斑块和不稳定斑块的形成和破裂中发挥作用[12]。NF-κB是一种氧化还原敏感的转录因子，调节免疫和炎症反应的各个方面[13]。NF-κB 通路的激活将导致 IL-1β、IL-6和 TNF-α等促炎细胞因子的过度产生[14]。本研究AS模型小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均升高，主动脉内膜p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平升高，表明AS小鼠体内NF-κB p65通路处于活化状态，炎性反应增强，造成主动脉血管病理学损伤。研究发现，NLRP3炎症小体可通过募集ASC并促进Caspase-1激活来调节内皮细胞的焦亡[15]。一些研究已经证明多达70种Caspase-1蛋白底物在AS和血管炎症中起作用[16]。活化的Caspase-1可引起促细胞凋亡的促炎形式，称为细胞焦亡，其特征是细胞溶解并将细胞质内含物释放到细胞外空间[17]，从而导致炎症。本研究AS小鼠主动脉内膜中NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表达水平均升高，说明细胞焦亡相关蛋白在AS小鼠主动脉内膜中大量表达，其介导的细胞焦亡与AS发生进程密切相关。

利拉鲁肽作为GLP-1类似物，常用于糖尿病的治疗，在临床使用过程中表现出良好的安全性[18]。Rakipovski等[19]研究发现，利拉鲁肽可通过抑制炎症反应，减轻AS病变和保护血管内皮，而且该功能的发挥与降糖作用无关。本研究中，AS小鼠在利拉鲁肽作用下，小鼠主动脉血管壁的增厚程度减轻，斑块面积减少，仅可见少量炎性细胞浸润，血清炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低，LDL-C、TG、TC水平降低，HDL-C水平升高，主动脉内膜中p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达水平降低。有研究在评估利拉鲁肽对TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞损伤时发现，利拉鲁肽可通过抑制NF-κB激活对内皮细胞产生明显的抗氧化和抗炎作用[20]。这提示利拉鲁肽可能通过抑制NF-κB激活，减轻AS小鼠炎症反应，减少血管壁斑块沉积。另外，利拉鲁肽预处理可有效抑制TNF-α和NLRP3炎症小体活化，抑制TNF-α和缺氧导致的心肌细胞焦亡，发挥心脏保护作用[21]。在研究利拉鲁肽对非酒精性肝炎中发现，利拉鲁肽可通过线粒体抑制NLRP3炎症小体诱导的细胞焦亡，减慢非酒精性脂肪性肝炎的进程[22]。本研究中，利拉鲁肽可明显降低AS小鼠主动脉内膜中NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表达水平；而与利拉鲁肽组相比，利拉鲁肽和GLP-1受体抑制剂exendin（9-39）的双重作用下的AS小鼠的病理学变化加重，血清炎症因子水平、血脂水平及主动脉内膜中NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表达水平均升高，表明利拉鲁肽可抑制AS小鼠主动脉内膜中NLRP3炎症小体活化，且GLP-1受体抑制剂可逆转利拉鲁肽对AS小鼠炎症反应及主动脉病理学损伤的改善作用。

综上所述，利拉鲁肽可能通过抑制NF-κB/NLRP3信号通路，减轻AS小鼠的主动脉内膜中的炎症反应和细胞焦亡，改善主动脉病理学损伤。但GLP-1对AS小鼠的作用机制比较复杂，其类似物利拉鲁肽的药效作用仍需进一步研究。