低分子肝素用于不明原因胚胎反复种植失败患者辅助生殖的效果研究

张焕焕 江美燕 张红艳 黄坚 费小阳

胚胎反复种植失败（recurrent implantation failure,RIF）是目前生殖领域关注的焦点问题，目前暂无统一的诊断标准，一般是指连续两次优质胚胎移植，累计移植第3天优质胚胎数目≥4枚或囊胚≥2枚仍未妊娠[1]。RIF常见原因包括子宫因素、输卵管积水、胚胎因素、染色体因素、免疫因素、子宫内膜不同步等，但目前仍有50%～60%的患者找不到原因[2]。近年来有不少学者开始研究低分子肝素在RIF患者中的疗效，但多为观察性研究，部分随机对照试验又存在异质性或样本量较小。因此，目前关于抗凝检查和治疗对RIF患者是否有益尚无统一定论。本研究对低分子肝素用于不明原因胚胎RIF患者辅助生殖的临床效果作一探讨，以期为临床用药提供参考，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2017年3月至2020年9月在杭州市妇产科医院生殖中心行体外受精胚胎移植助孕的不明原因 RIF患者222例，年龄 22～40（33.43±5.16）岁。按随机数字表法分成两组，即肝素组114例、对照组108例。两组患者年龄、不孕类型、不孕年限、基础抗缪勒管激素（antimullerian hormone,AMH）水平、BMI、既往足月产史比例、既往难免流产史比例等一般资料比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。纳入标准：新鲜/冷冻胚胎移植2个及以上周期，移植第3天优质胚胎≥4枚或第5天囊胚≥2枚仍未妊娠。排除标准：（1）年龄＞40岁；（2）卵巢储备功能低下[AMH＜1.1 g/L和（或）双侧基础窦卵总数≤5枚]；（3）存在子宫因素、输卵管积水、染色体异常、抗磷脂抗体综合征、风湿免疫性疾病、血栓前状态等；（4）肝肾功能异常；（5）对低分子肝素过敏；（6）病例资料不全或拒绝参加本临床试验者。本研究经本院医学伦理委员会审查通过，所有患者签署知情同意书。

表1 两组患者一般资料比较

1.2 治疗方法 （1）对照组给予常规黄体支持治疗[3]：新鲜胚胎移植自移植日起予以地屈孕酮片（规格：10 mg/片，批号：363429，比利时苏威制药）20 mg/次、2次/d口服+黄体酮针（规格：20mg/支，批号：201203，仙居制药）40 mg/次、1次/d肌肉注射；冷冻胚胎移植自移植日起予以地屈孕酮片20 mg/次、2次/d口服+黄体酮针40 mg/次、2次/d肌肉注射+戊酸雌二醇片（规格：1 mg/片，批号：624A，德国拜耳医药）4 mg/次、2次/d口服。（2）肝素组在常规黄体支持的基础上加用低分子肝素钙注射液（规格：4 100 U/支，批号：9369，英国葛兰素史克公司）4 100 U/次、1次/d皮下注射。自胚胎移植日开始使用，移植后12 d人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,hCG）阴性者停用，hCG阳性者持续使用至移植后40 d超声检查见胎心搏动，未见胎心搏动者停用。

1.3 观察指标 观察并比较两组患者辅助生殖情况（平均助孕周期数、优质胚胎移植数等）、临床妊娠结局（临床妊娠率、流产率）等。优质胚胎按照国际形态学标准进行评分[4]：第3天1、2级胚胎和第5天3BB以上囊胚为优质胚胎。移植后26 d超声检查示宫内孕囊回声为临床妊娠；移植后40 d超声检查未见胎心搏动提示难免流产。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者辅助生殖情况比较 肝素组行辅助生殖助孕周期数418个，其中新鲜胚胎移植周期数94个，冷冻胚胎移植周期数324个；对照组行辅助生殖助孕周期数341个，其中新鲜胚胎移植周期数113个，冷冻胚胎移植周期数228个；两组患者新鲜及冷冻胚胎移植周期比例比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。肝素组与对照组平均助孕周期数、优质胚胎移植数比较，差异亦均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

表2 两组患者平均助孕周期数及优质胚胎移植数比较（个）

2.2 两组患者临床妊娠结局比较 肝素组临床妊娠率为 50.0%（57/114），流产率为 10.5%（6/57）；对照组临床妊娠率为 41.7%（45/108），流产率为 11.1%（5/45）；两组患者临床妊娠率、流产率比较，差异均无统计学意义（均 P＞0.05）。

2.3 有无难免流产史患者临床妊娠结局比较 肝素组有难免流产史33例，无难免流产史81例；组内有无难免流产史患者临床妊娠率及流产率比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。对照组有难免流产史27例，无难免流产史81例；无难免流产史患者临床妊娠率明显高于有难免流产史患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；组内有无难免流产史患者流产率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。有难免流产史患者中，肝素组临床妊娠率明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 有无难免流产史患者临床妊娠结局比较[例（%）]

3 讨论

随着辅助生殖技术的不断发展与突破，更多不可能自然受孕的夫妇实现生育，但临床上仍有约10%的夫妇存在RIF。目前关于RIF尚无统一的诊断标准。有学者认为经历3次及以上胚胎移植且每次移植1～2个优质胚胎仍未获得临床妊娠可诊断为RIF[5]。但也有学者认为相对于胚胎移植次数，移植胚胎质量更应该被关注[6]。本研究采用的RIF诊断标准依据某项系统回顾研究，该文作者根据当下现有文献及专家意见提出：连续两次优质胚胎移植，累计移植第3天优质胚胎数目≥4枚或囊胚≥2枚仍未妊娠可诊断为RIF[1]。RIF的临床表现包括移植后血hCG阴性、移植后血hCG阳性但超声检查未见宫内孕囊回声（即生化妊娠）。

胚胎移植是指胚胎黏附于子宫内膜上皮表面，然后逐步侵入子宫内膜深层。影响胚胎移植的因素很多，包括子宫因素、输卵管因素、胚胎因素、染色体因素、免疫因素、血栓前状态等。此外，也包括生殖高龄、肥胖、压力大等[7]。移植前行超声检查有助于排除先天性子宫畸形、子宫腺肌症、子宫肌瘤、子宫内膜息肉、宫腔粘连、输卵管积水等，必要时可行腹腔镜探查及宫腔镜检查。免疫因素及血栓前状态是最近研究的热点。子宫内膜基质细胞蜕膜化，可调控滋养细胞入侵，从而抑制局部的母体免疫反应，协助胚胎移植。复发性流产患者抗心磷脂抗体、抗核抗体和抗甲状腺过氧化物酶抗体阳性，TNF、IFN-γ、IL-6、辅助性T细胞 17水平均升高，Foxp3+调节性T细胞减少，母体对胎儿或胎盘滋养层抗原的免疫反应失调[8]。目前，低分子肝素广泛用于复发性流产患者的治疗中[9]，其作用机制包括抗凝以及潜在的免疫调节和抗炎作用[10]。此外，低分子肝素也可能参与调节母胎的免疫耐受，如预防滋养层细胞凋亡[11]，增强滋养层侵袭性等[12]。反复生化妊娠在病因学上与复发性流产高度相似，专家建议对反复生化妊娠患者可按照复发性流产诊治规范进行管理，先进行严格病因筛查，再根据病因进行抗凝治疗。但目前对RIF患者行抗凝治疗是否有益仍存在争议。有研究表明，RIF与高凝状态具有相关性[13-14]。但也有研究表明，相较于对照组，RIF患者与血液高凝状态并未见更高的相关性[15-16]。有学者总结基因多态性与血栓易感性的多项研究，得出血栓前状态在RIF患者中更为常见[17]。Qublan等[18]的一项随机对照研究将83例RIF患者随机分配至低分子肝素组与对照组（0.9%氯化钠溶液），结果显示肝素组种植率、妊娠率、活产率均明显高于对照组，提示获得性和遗传性高凝状态与RIF有关。Noci等[19]为评估抗凝治疗能否使体外受精胚胎移植助孕患者受益，纳入第1次行体外受精胚胎移植助孕且实验室检查无血液高凝状态、年龄＜40岁的患者172例，然后随机分配至低分子肝素组和对照组，结果显示肝素组临床妊娠率和活产率较对照组明显升高，但差异无统计学意义。

2018年Yang等[20]的一项Meta分析纳入无血液高凝状态的RIF患者935例，其中458例接受低分子肝素治疗，477例接受常规黄体支持，结果显示低分子肝素并未提高无血液高凝状态的RIF患者临床妊娠率。本研究结果表明，肝素组与对照组临床妊娠率、流产率比较，差异均无统计学意义。进一步分析有无难免流产史患者临床妊娠结局显示，肝素组有无难免流产史患者临床妊娠率及流产率比较，差异均无统计学意义；对照组无难免流产史患者临床妊娠率明显高于有难免流产史患者，但有无难免流产史患者流产率比较差异无统计学意义；有难免流产史患者中，肝素组临床妊娠率明显高于对照组。

综上所述，低分子肝素能使有难免流产史的不明原因RIF患者受益，临床妊娠率明显增加；对于无难免流产史的不明原因RIF患者，使用低分子肝素未见临床妊娠率及流产率明显改善。此外，并不推荐对体外受精胚胎移植助孕的RIF患者行常规抗凝治疗，若使用也应严格把握抗凝治疗的适用人群、起止时间、药物剂量等。