循环肿瘤DNA与结直肠癌RAS、BRAF基因突变的相关性

陈飞 程祺 姜峰 隋殿晶

(吉林省肿瘤医院内四科，吉林 长春 130012)

结直肠癌是全球常见高度恶性肿瘤之一，其发病率现已居第3位，肿瘤相关性死亡由于结直肠癌引发的已占9%左右〔1〕。近年来，随着对肿瘤的研究不断深入，基因检测和靶向药物治疗已成为热门领域，同时也对结直肠癌患者的生存起到了一定改善作用〔2〕。目前对于结直肠癌的研究中RAS通路已趋于成熟，其中KRAS/BRAF/NRAS基因是常用检测位点，且突变提示表皮生长因子受体(EGFR)单抗类药物耐药，故国内外各指南均推荐结直肠癌患者进行RAS通路的位点检测〔3，4〕。目前实际工作中对于基因的检查仅通过活体肿瘤组织进行，但组织活检存在其自身的局限性，且无法克服肿瘤组织中存在的空间及时间异质性〔5〕。循环肿瘤DNA(ctDNA)主要指肿瘤细胞已释放进入血液循环中的DNA片段，被认为包含有肿瘤组织的完整基因信息。ctDNA最大的优势在于简便、微创及动态检测，目前已成为基因检测最热门的样本。既往诸多研究显示〔6，7〕，ctDNA的检测能够对结直肠癌的预后及疗效进行预测，但ctDNA与活体组织标本所测DNA之间的差异研究较少，本研究旨在探讨ctDNA与组织标本DNA所测基因突变的一致性及其相关因素。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取吉林省肿瘤医院2019年1月至2020年12月收治的转移性结直肠癌患者61例。年龄30～78岁，中位年龄58岁；男38例，女23例；原发病部位左半结肠26例(42.6%)，右半结肠16例(26.2%)，直肠19例(31.1%)；转移数：<2个34例(55.7%)，≥2个27例(44.3%)；肝转移42例(68.9%)，无肝转移19例(31.1%)；肺转移27例(44.3%)，无肺转移34例(55.7%)；盆腔转移13例(21.3%)，无盆腔转移48例(78.7%)；远处淋巴结转移11例(18.0%)，无远处淋巴结转移50例(82.0%)。纳入标准：(1)年龄≥30 岁；(2)病理组织学或细胞学确诊为转移性结直肠腺癌，影像学证实存在1个或多个转移灶；(3)能够提供肿瘤组织标本进行KRAS、NRAS、BRAF 基因检测；(4)不伴有其他原发肿瘤。本次研究获得医院伦理委员会审核通过，所有患者及家属对本研究知情同意并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1样本的采集及处理 在开始治疗前抽取患者外周静脉血10 ml， 放入专用的含EDTA抗凝血剂和细胞防腐剂的BCT管中，轻轻倒转8～10次，常温下保存和运输，2 h内进行离心处理。

1.2.2ctDNA的提取 参照DNA提取试剂盒说明书步骤进行提取，提取好的DNA样本，使用Qubit3.0荧光计检测其浓度，浓度在2 ng/μl以上为合格。

1.2.3RAS(KRAS、NRAS)、BRAF基因检测 应用微滴式数字PCR(ddPCR)技术平台进行ctDNA及肿瘤组织标本RAS(KRAS、NRAS)、BRAF基因突变检测，生成检测报告。

1.3统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件进行Kappa值符合率比较、χ2检验及多因素回归分析。

2 结 果

2.1患者基因突变情况 61例患者肿瘤组织基因突变检测结果：KRAS突变型患者26例(42.6%)，野生型35例(57.4%)；NRAS突变型5例(8.2%)，野生型56例(91.8%)BRAF突变型5例(8.2%)，野生型56例(91.8%)；61例患者血浆ctDNA基因突变结果：KRAS基因突变型患者21例(34.4%)，野生型40例(65.6%)；NRAS突变型3例(4.9%)，野生型58例(95.1%)；BRAF突变型患者4例(6.6%)，野生型57例(93.4%)。

2.2两种方法结果一致性比较 KRAS：血浆ctDNA与组织检测突变结果对比，KRAS突变型一致性为 85.2%(Kappa=0.831，P<0.05)，灵敏度 73.1%，特异性94.3%。NRAS：血浆ctDNA与组织检测突变结果对比，NRAS突变型一致性为 93.4%(Kappa=0.769，P<0.05)，灵敏度40.0%，特异性98.2%。BRAF：血浆ctDNA与组织检测突变结果对比,BRAF突变型一致性为 95.1%(Kappa=0.833，P<0.05)，灵敏度60.0%，特异性98.2%。

2.3影响一致性的因素分析 两组方法在检测基因位点突变时，一致率较高，单因素分析结果显示，初诊治疗情况是影响一致性的因素(P<0.05)，见表1。将单因素分析具有统计学意义的因素进行多因素Logistic回归分析，结果显示，初诊治疗情况及肝转移是影响两种方法检测一致性的因素，见表2。

表1 影响一致性的单因素分析〔n(%)〕

表2 多因素回归分析

3 讨 论

随着肿瘤发病率的增加及对肿瘤研究的不断深入，诸多研究已报道结直肠癌的发病与基因突变存在密切相关性〔8，9〕，基于基因检测的肿瘤分子分型及个体化治疗方案已成为转移性结直肠癌的常规治疗模式。结直肠癌基因检测取材于肿瘤组织，组织获取为有创性操作，在同一例患者无法反复多次进行。循环肿瘤DNA基因检测是一项非侵入式检测的“液体活检”技术。本研究通过ddPCR法检测了61例转移性结直肠癌患者血浆ctDNA及肿瘤组织中RAS(KRAS、NRAS)、BRAF基因突变情况，结果与既往研究中的一致率接近(89%～93%)〔10〕。两种方法对于突变基因检测的结果仍存在一定不一致性，其受到多种因素的影响，首先两种方法所选用的标本采集时间不完全相同，其次本研究患者在进行血浆ctDNA的检测时已进行了相关抗肿瘤治疗，会导致血浆中ctDNA浓度下降，最终使得结果存在一定偏倚。最后ctDNA对于基因突变的检测灵敏度较高，也可能出现了活体组织中在低丰度未检测出的位点在ctDNA检测中呈现出阳性的情况〔11，12〕。另一方面，不同肿瘤组织间，原发灶及转移灶不同转移灶之间存在肿瘤异质性，也是导致两种方法检查结果不一致的原因之一。

本研究发现，存在组织基因野生且经过抗EGFR治疗后，经ctDNA检测KRAS、BRAF、NRAS发生突变，与既往报道结果相似〔13〕。结果进一步提升，在接受抗EGFR治疗期间，通过对ctDNA的检测能够及时发现药物的耐药性，所有位点基因中最为常见的突变为KRAS突变。既往研究也发现〔14〕，经过动态的ctDNA连续性监测，能够观察到抗EGFR药物治疗后会诱发KRAS的突变，在停止治疗后，突变的丰度也会随之下降及消失，若再次恢复治疗可获得一定收益。故而对于ctDNA进行动态的连续性监测能够更加准确地对靶向治疗进行指导〔15，16〕。本研究发现肝转移患者居多，且有半数以上患者伴有其他部位转移，此部分患者则存在肿瘤负荷较高的情况，故而对于肝转移患者的不同方法检测，一致率较高。既往研究表明〔17〕，ctDNA的水平与相关肿瘤负荷存在密切相关性，当肿瘤负荷较低时，ctDNA出现假阴性的概率较高，两种方法检测结果的一致性也更低。

综上，两种方法对于结直肠癌患者基因突变检测一致性较高，导致不一致的主要原因可能与既往诊疗情况有密切关系。本研究仍存在一定不足，首先本研究仅为单中心研究，纳入样本量较小；其次对于患者后续未进行相关随访，未能够对两种方法检测不一致的患者进行预后追踪。下一步仍需进行多中心及大样本量的临床研究。